Abstract Each tumor contains malignant cells that differ in genotype, phenotype, and in their interactions with the tumor micro-environment (TME). This results in distinct integrated cellular states that govern intra-tumor heterogeneity (ITH), a central challenge of cancer therapeutics. Dozens of recent studies have begun to describe ITH by single cell RNA-seq, but each study typically profiledonly a small number of tumors and provided a narrow view of transcriptional ITH. Here, we curate, annotate and integrate the data from 77 different studies to reveal the patterns of ITH across 1,163 tumor samples covering 24 tumor types. Focusing on the malignant cells, we find thousands of transcriptional ITH programs that can be described by 41 consensus meta-programs (MPs), each consisting of dozens of genes that are coordinately upregulated in subpopulations of cells within many different tumors. The MPs cover diverse cellular processes and differ in their cancer-type distribution. General MPs associated with processes such as cell cycle and stress vary within most tumors, while context-specific MPs reflect the unique biology of particular cancer types, often resembling developmental cell types and suggesting the co-existence of variable differentiation states within tumors. Some of the MPs are further associated with overall tumor proliferation or immune state, highlighting their potential clinical significance. Based on functional similarities among MPs, we propose a set of 11 hallmarks that together account for the majority of observed ITH programs. Given the breadth and scope of the investigated cohort, the MPs and hallmarks described here reflect the first comprehensive pan-cancer description of transcriptional ITH.

Abstract Despite standard treatment, IDH-mutant gliomas inevitably recur. Previous studies suggest that therapeutic resistance may result from a combination of intratumoral cellular heterogeneity, epigenetic evolution, and acquired genetic alterations. However, how these multilayered molecular features interact to influence the evolutionary paths of IDH-mutant gliomas remains incompletely understood. To chart this evolution, 75 glioma samples were longitudinally collected from 35 patients (n = 13 oligodendroglioma, n = 22 astrocytoma) and profiled using single nucleus RNA sequencing, ATAC sequencing, and bulk DNA sequencing. Analysis of 331,016 nuclei (snRNA) revealed eight tumor microenvironment cell types and five pan-IDH-mutant malignant cellular states. The malignant states were distributed along a cellular hierarchy of stem-like populations (neural progenitor cell-like, oligodendrocyte progenitor cell-like, and undifferentiated) and more differentiated populations (mesenchymal-like and astrocyte-like) with cycling cells enriched in the stem-like populations. Joint open chromatin accessibility data (snATAC) was available for a subset of malignant cells (71,088 nuclei) and state-specific differentially accessible peaks supported that these states are epigenetically encoded. Across both subtypes, higher tumor grade was associated with reduced malignant cell differentiation and increased cycling populations. Between the two time points, we identified that there was a longitudinal increase in the cycling, undifferentiated, and mesenchymal-like populations with a corresponding decrease in the astrocyte-like population. Longitudinal genetic analysis revealed that 19 of 35 tumors acquired at least one of the following genetic alterations: treatment-associated hypermutation, cell cycle alteration, or large changes in copy number alterations. Importantly, tumors that acquired these key genetic alterations demonstrated significant shifts towards reduced differentiation and increased cycling populations while those tumors that did not had more stable malignant profiles. Collectively, our results suggest a common cellular hierarchy across IDH-mutant gliomas with a shift towards reduced differentiation, increased cycling populations during disease progression that is driven by acquired genetic alterations.

Abstract The evolution of cellular heterogeneity in IDH-wildtype glioblastoma (GBM) after standard-of-care therapy remains poorly understood. To address it, we assembled a longitudinal cohort of 121 primary and recurrent GBM specimens from 59 patients, with extensive clinical annotations, and profiled it by single-nucleus RNA-sequencing and bulk tumor DNA sequencing. In most cases, longitudinal samples diverged in their composition of cell types and cell states. However, almost all theoretical trajectories were observed in our cohort such that the overall distribution of cell types and cell states was comparable between primary and recurrent samples. The most consistent longitudinal effect (66% of patients) was a lower malignant cell fraction at recurrence and a reciprocal increase in proportions of glio-neuronal TME cell types; in some cases, this was further accompanied by a coordinated shift of malignant cells towards neuronal-like states. MGMT methylation and radiation-related small deletion phenotypes were linked to particular trajectories, with depletion of mesenchymal-like cells and enrichment of hypoxia-related malignant cells, respectively. Importantly, changes in malignant states were also associated with specific changes in TME composition. In summary, our analysis highlights diverse longitudinal GBM trajectories that are shaped by treatment response and TME interactions.

Abstract IDH-mutant gliomas exhibit variable responses to mutant-IDH inhibitor (IDHi) therapy; yet, the molecular mechanisms underlying these responses remain poorly understood. Here, we investigate the cellular underpinnings of response by leveraging single cell/nuclei RNA-sequencing of on-treatment IDH-mutant oligodendroglioma tumor samples resected from three patients who benefited clinically from treatment. We integrate these findings with single cell and bulk RNA-seq data from independent cohorts and experimental models. We find that IDHi treatment promotes robust differentiation towards the astrocytic lineage, accompanied by stem-like cell depletion and reduced proliferation. Notably, NOTCH1 mutations are associated with impaired astrocytic differentiation, potentially negatively impacting response to IDHi. This study unveils the differentiating effects of IDHi on oligodendroglioma cellular hierarchies and identifies a potential genetic marker for optimizing patient selection. Paper was recently published in Cancer Cell (10.1016/j.ccell.2024.03.008).

Abstract Neuroendocrine tumors (NETs) occur primarily in the small intestine, lung and pancreas. Due to their rarity compared to other malignancies in these organs, their complex biology remains poorly understood, including their oncogenesis, tumor composition and the intriguing phenomena of mixed neuroendocrine non-neuroendocrine neoplasms (MiNEN). Here we profiled ten low-grade small intestine NET (SiNET) tumor samples as well as one mixed lung tumor by single-cell or single-nuclei RNA-seq. We find that SiNETs are largely separated into two distinct subtypes, in which the neuroendocrine cells upregulate epithelial or neuronal markers, respectively. Surprisingly, in both subtypes the neuroendocrine cells are largely non-proliferative while higher proliferation is observed in multiple non-malignant cell types. Specifically, B and plasma cells are highly proliferative in the epithelial-like SiNET subtype, potentially reflecting the outcome of high Migration Inhibitory Factor (MIF) expression in those tumors, which may constitute a relevant target. Finally, our analysis of a mixed lung neuroendocrine tumor identifies a population of putative progenitor cells that may give rise to both neuroendocrine and non-neuroendocrine (squamous) cells, potentially explaining the origin of the mixed histology. Taken together, our results provide important insights and hypotheses regarding the biology of neuroendocrine neoplasms.

The role of the nervous system in the regulation of cancer is increasingly appreciated. In gliomas, neuronal activity drives tumour progression through paracrine signalling factors such as neuroligin-3 and brain-derived neurotrophic factor1–3 (BDNF), and also through electrophysiologically functional neuron-to-glioma synapses mediated by AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) receptors4,5. The consequent glioma cell membrane depolarization drives tumour proliferation4,6. In the healthy brain, activity-regulated secretion of BDNF promotes adaptive plasticity of synaptic connectivity7,8 and strength9–15. Here we show that malignant synapses exhibit similar plasticity regulated by BDNF. Signalling through the receptor tropomyosin-related kinase B16 (TrkB) to CAMKII, BDNF promotes AMPA receptor trafficking to the glioma cell membrane, resulting in increased amplitude of glutamate-evoked currents in the malignant cells. Linking plasticity of glioma synaptic strength to tumour growth, graded optogenetic control of glioma membrane potential demonstrates that greater depolarizing current amplitude promotes increased glioma proliferation. This potentiation of malignant synaptic strength shares mechanistic features with synaptic plasticity17–22 that contributes to memory and learning in the healthy brain23–26. BDNF–TrkB signalling also regulates the number of neuron-to-glioma synapses. Abrogation of activity-regulated BDNF secretion from the brain microenvironment or loss of glioma TrkB expression robustly inhibits tumour progression. Blocking TrkB genetically or pharmacologically abrogates these effects of BDNF on glioma synapses and substantially prolongs survival in xenograft models of paediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma. Together, these findings indicate that BDNF–TrkB signalling promotes malignant synaptic plasticity and augments tumour progression.