Abstract Current methods for evaluating the accuracy of germline variant calls are restricted to easy-to-detect high-confidence regions, thus ignoring a substantial portion of difficult variants beyond the benchmark regions. We established four DNA reference materials from immortalized cell lines derived from a Chinese Quartet including parents and monozygotic twins. We integrated benchmark calls of 4.2 million small variants and 15,000 structural variants from multiple platforms and bioinformatic pipelines for evaluating the reliability of germline variant calls inside the benchmark regions. The genetic built-in-truth of the Quartet family design not only improved sensitivity of benchmark calls by removing additional false positive variants with apparently high quality, but also enabled estimation of the precision of variants calls outside the benchmark regions. Batch effects of variant calling in large-scale DNA sequencing efforts can be effectively identified with the concurrent use of the Quartet DNA reference materials along with study samples, and can be alleviated by training a machine learning model with the Quartet reference datasets to remove potential artifact calls. Matched RNA and protein reference materials were also established in the Quartet project, thereby enabling benchmark calls constructed from DNA reference materials for evaluation of variants calling performance on RNA and protein data. The Quartet DNA reference materials from this study are a resource for objective and comprehensive assessment of the accuracy of germline variant calls throughout the whole-genome regions.

Abstract Arabidopsis thaliana is an important and long-established model species for plant molecular biology, genetics, epigenetics, and genomics. However, the latest version of reference genome still contains significant number of missing segments. Here, we report a high-quality and almost complete Col-0 genome assembly with two gaps (Col-XJTU) using combination of Oxford Nanopore Technology ultra-long reads, PacBio high-fidelity long reads, and Hi-C data. The total genome assembly size is 133,725,193 bp, introducing 14.6 Mb of novel sequences compared to the TAIR10.1 reference genome. All five chromosomes of Col-XJTU assembly are highly accurate with consensus quality (QV) scores > 60 (ranging from 62 to 68), which are higher than those of TAIR10.1 reference (QV scores ranging from 45 to 52). We have completely resolved chromosome (Chr) 3 and Chr5 in a telomere-to-telomere manner. Chr4 has been completely resolved except the nucleolar organizing regions, which comprise long repetitive DNA fragments. The Chr1 centromere (CEN1), reportedly around 9 Mb in length, is particularly challenging to assemble due to the presence of tens of thousands of CEN180 satellite repeats. Using the cutting-edge sequencing data and novel computational approaches, we assembled about 4 Mb of sequence for CEN1 and a 3.5-Mb-long CEN2. We investigated the structure and epigenetics of centromeres. We detected four clusters of CEN180 monomers, and found that the centromere-specific histone H3-like protein (CENH3) exhibits a strong preference for CEN180 cluster 3. Moreover, we observed hypomethylation patterns in CENH3-enriched regions. We believe that this high-quality genome assembly, Col-XJTU, would serve as a valuable reference to better understand the global pattern of centromeric polymorphisms, as well as genetic and epigenetic features in plants.

Abstract As the state-of-the-art sequencing technologies and computational methods enable investigation of challenging regions in the human genome, an update variant benchmark is demanded. Herein, we sequenced a Chinese Quartet, consisting of two monozygotic twin daughters and their biological parents, with multiple advanced sequencing platforms, including Illumina, BGI, PacBio, and Oxford Nanopore Technology. We phased the long reads of the monozygotic twin daughters into paternal and maternal haplotypes using the parent-child genetic map. For each haplotype, we utilized advanced long reads to generate haplotype-resolved assemblies (HRAs) with high accuracy, completeness, and continuity. Based on the ingenious quartet samples, novel computational methods, high-quality sequencing reads, and HRAs, we established a comprehensive variant benchmark, including 3,883,283 SNVs, 859,256 Indels, 9,678 large deletions, 15,324 large insertions, 40 inversions, and 31 complex structural variants shared between the monozygotic twin daughters. In particular, the preciously excluded regions, such as repeat regions and the human leukocyte antigen (HLA) region, were systematically examined. Finally, we illustrated how the sequencing depth correlated with the de novo assembly and variant detection, from which we learned that 30 × HiFi is a balance between performance and cost. In summary, this study provides high-quality haplotype-resolved assemblies and a variant benchmark for two Chinese monozygotic twin samples. The benchmark expanded the regions of the previous report and adapted to the evolving sequencing technologies and computational methods.

Abstract Background Recent advances in long-read callers and assembly methods have greatly facilitated structural variants (SV) detection via read-based and assembly-based detection strategies. However, the lack of comparison studies, especially for SVs at complex genomic regions, complicates the selection of proper detection strategy for ever-increasing demand of SV analysis. Results In this study, we compared the two most widely-used strategies with six long-read datasets of HG002 genome and benchmarked them with well curated SVs at genomic regions of different complexity. First of all, our results suggest that SVs detected by assembly-based strategy are slightly affected by assemblers on HiFi datasets, especially for its breakpoint identity. Comparably, though read-based strategy is more versatile to different sequencing settings, aligners greatly affect SV breakpoints and type. Furthermore, our comparison reveals that 70% of the assembly-based calls are also detectable by read-based strategy and it even reaches 90% for SVs at high confident regions. While 60% of the assembly-based calls that are totally missed by read-based callers is largely due to the challenges of clustering ambiguous SV signature reads. Lastly, benchmarking with SVs at complex genomic regions, our results show that assembly-based approach outperforms read-based calling with at least 20X coverage, while read-based strategy could achieve 90% recall even with 5X coverage. Conclusions Taken together, with sufficient sequencing coverage, assembly-based strategy is able to detect SVs more consistently than read-based strategy under different settings. However, read-based strategy could detect SVs at complex regions with high sensitivity and specificity but low coverage, thereby suggesting its great potential in clinical application.

ABSTRACT We developed MSIsensor-pro ( https://github.com/xjtu-omics/msisensor-pro ), an open-source single sample microsatellite instability (MSI) scoring method for research and clinical applications. MSIsensor-pro introduces a multinomial distribution model to quantify polymerase slippages for each tumor sample and a discriminative sites selection method to enable MSI detection without matched normal samples. For samples of various sequencing depths and tumor purities, MSIsensor-pro significantly outperformed the current leading methods in terms of both accuracy and computational cost.

Tandem duplication (TD) is a major type of structural variation (SV), and plays an important role in novel gene formation and human diseases. However, TDs are often missed or incorrectly classified as insertions by most of modern SV detection methods due to the lacking of specialized operation on TD related mutational signals. Herein, we developed a TD detection module of Pindel referred as Pindel-TD based on a TD specific pattern growth approach. Pindel-TD detects TDs with a wide size range at single nucleotide resolution. Using simulation and real read data of HG002, we demonstrate that Pindel-TD outperformed other leading methods in terms of precision, recall, F1-score and robustness. Further applying Pindel-TD on data generated from K562 cancer cell line, we identified a TD located at the seventh exon of SAGE1, explaining its high expression. Pindel-TD is available at https://github.com/xjtu-omics/pindel and free for non-commercial use.

Long-read-based de novo and somatic structural variant (SV) discovery remains challenging, necessitating genomic comparison between samples. We developed SVision-pro, a neural-network-based instance segmentation framework that represents genome-to-genome-level sequencing differences visually and discovers SV comparatively between genomes without any prerequisite for inference models. SVision-pro outperforms state-of-the-art approaches, in particular, the resolving of complex SVs is improved, with low Mendelian error rates, high sensitivity of low-frequency SVs and reduced false-positive rates compared with SV merging approaches.

Background: Microsatellite instability (MSI) is an indispensable biomarker in cancer immunotherapy. Currently, MSI scoring methods by high-throughput omics methods have gained popularity and demonstrated better performance than the gold standard method for MSI detection. However, MSI detection method on expression data, especially single-cell expression data is still lacking, limiting the scope of clinical application and prohibiting investigation of MSI at single cell level. Results: Herein, we developed MSIsensor-RNA, an accuracy, robust, adaptable, and standalone software, to detect MSI status by its associated genes9 expression values. We demonstrated the favorable performance and promise of MSIsensor-RNA in both bulk and single-cell gene expression data in multiplatform technologies including RNA-seq, Microarray, and single-cell RNA-seq. Conclusions: MSIsensor-RNA is a versatile, efficient, and robust method for MSI status detection from both bulk and single-cell gene expression data in clinical researches and applications. MSIsensor-RNA is available at https://github.com/xjtu-omics/msisensor-rna.