Quantitative proteomics has traditionally been performed by two-dimensional gel electrophoresis, but recently, mass spectrometric methods based on stable isotope quantitation have shown great promise for the simultaneous and automated identification and quantitation of complex protein mixtures. Here we describe a method, termed SILAC, for stable isotope labeling by amino acids in cell culture, for the in vivo incorporation of specific amino acids into all mammalian proteins. Mammalian cell lines are grown in media lacking a standard essential amino acid but supplemented with a non-radioactive, isotopically labeled form of that amino acid, in this case deuterated leucine (Leu-d3). We find that growth of cells maintained in these media is no different from growth in normal media as evidenced by cell morphology, doubling time, and ability to differentiate. Complete incorporation of Leu-d3 occurred after five doublings in the cell lines and proteins studied. Protein populations from experimental and control samples are mixed directly after harvesting, and mass spectrometric identification is straightforward as every leucine-containing peptide incorporates either all normal leucine or all Leu-d3. We have applied this technique to the relative quantitation of changes in protein expression during the process of muscle cell differentiation. Proteins that were found to be up-regulated during this process include glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, fibronectin, and pyruvate kinase M2. SILAC is a simple, inexpensive, and accurate procedure that can be used as a quantitative proteomic approach in any cell culture system. Quantitative proteomics has traditionally been performed by two-dimensional gel electrophoresis, but recently, mass spectrometric methods based on stable isotope quantitation have shown great promise for the simultaneous and automated identification and quantitation of complex protein mixtures. Here we describe a method, termed SILAC, for stable isotope labeling by amino acids in cell culture, for the in vivo incorporation of specific amino acids into all mammalian proteins. Mammalian cell lines are grown in media lacking a standard essential amino acid but supplemented with a non-radioactive, isotopically labeled form of that amino acid, in this case deuterated leucine (Leu-d3). We find that growth of cells maintained in these media is no different from growth in normal media as evidenced by cell morphology, doubling time, and ability to differentiate. Complete incorporation of Leu-d3 occurred after five doublings in the cell lines and proteins studied. Protein populations from experimental and control samples are mixed directly after harvesting, and mass spectrometric identification is straightforward as every leucine-containing peptide incorporates either all normal leucine or all Leu-d3. We have applied this technique to the relative quantitation of changes in protein expression during the process of muscle cell differentiation. Proteins that were found to be up-regulated during this process include glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, fibronectin, and pyruvate kinase M2. SILAC is a simple, inexpensive, and accurate procedure that can be used as a quantitative proteomic approach in any cell culture system. Proteomics, the large scale study of the protein complement of a cell or tissue, has its origins in the technology of two-dimensional (2D) 1The abbreviations used are: 2D, two-dimensional; ICAT, isotope-coded affinity tag; MS, mass spectrometry; MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight; MS/MS, tandem MS; 1D, one-dimensional. gel electrophoresis invented more than 25 years ago (1.O’Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.J. Biol. Chem. 1975; 250: 4007-4021Google Scholar, 2.Klose J. Kobalz U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.Electrophoresis. 1995; 16: 1034-1059Google Scholar). In 2D gel electrophoresis, quantitation is achieved by recording differences in the staining pattern of proteins derived from two states of cell populations or tissues. Therefore, in addition to obtaining increasingly higher resolution, technology improvements in the 2D gel community have been directed toward the image analysis of 2D gels and the relative quantitation of protein spots by their intensity of staining (3.Gorg A. Obermaier C. Boguth G. Harder A. Scheibe B. Wildgruber R. Weiss W. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.Electrophoresis. 2000; 21: 1037-1053Google Scholar, 4.Herbert B.R. Harry J.L. Packer N.H. Gooley A.A. Pedersen S.K. Williams K.L. What place for polyacrylamide in proteomics?.Trends Biotechnol. 2001; 19: 3-9Abstract Full Text Full Text PDF Google Scholar, 5.Patton W.F. Beechem J.M. Rainbow’s end: the quest for multiplexed fluorescence quantitative analysis in proteomics.Curr. Opin. Chem. Biol. 2002; 6: 63-69Google Scholar, 6.Zhou G. Li H. DeCamp D. Chen S. Shu H. Gong Y. Flaig M. Gillespie J.W. Hu N. Taylor P.R. Emmert-Buck M.R. Liotta L.A. Petricoin III, E.F. Zhao Y. 2D differential in-gel electrophoresis for the identification of esophageal scans cell cancer-specific protein markers.Mol. Cell. Proteomics. 2002; 1: 117-124Google Scholar). Mass spectrometry has long been used in a quantitative manner in the small molecule field (7.Browne T.R. Van Langenhove A. Costello C.E. Biemann K. Greenblatt D.J. Kinetic equivalence of stable-isotope-labeled and unlabeled phenytoin.Clin. Pharmacol. Ther. 1981; 29: 511-515Google Scholar). Pharmacological researchers, for example, use isotopically labeled analogs of the compound of interest and add a known amount to the sample for analysis. This is because mass spectrometry is not quantitative per se because of varying detector response, differential ionization yields for different substances, and other factors. Observed peak ratios for isotopic analogs, however, are highly accurate, because there are no chemical differences between the species, and they are analyzed in the same experiment. One of the first uses of isotopic labels in proteomics was for improved sequence assignment in peptide sequencing by tandem mass spectrometry by incorporating 18O atoms at the C terminus of a peptide (8.Shevchenko A. Chernushevich I. Standing K.G. Thompson B. Wilm M. Mann M. Rapid “de novo” peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997; 11: 1015-1024Google Scholar, 9.Schnolzer M. Jedrzejewski P. Lehmann W.D. Protease-catalyzed incorporation of 18O into peptide fragments and its application for protein sequencing by electrospray and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.Electrophoresis. 1996; 17: 945-953Google Scholar, 10.Uttenweiler-Joseph S. Neubauer G. Christoforidis S. Zerial M. Wilm M. Automated de novo sequencing of proteins using the differential scanning technique.Proteomics. 2001; 1: 668-682Google Scholar). The 18O technique had already been used in protein chemistry and was subsequently shown to have interesting uses in quantitation, as well (11.Mirgorodskaya O.A. Kozmin Y.P. Titov M.I. Korner R. Sonksen C.P. Roepstorff P. Quantitation of peptides and proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using (18)O-labeled internal standards.Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000; 14: 1226-1232Google Scholar, 12.Yao X. Freas A. Ramirez J. Demirev P.A. Fenselau C. Proteolytic 18O labeling for comparative proteomics: model studies with two serotypes of adenovirus.Anal. Chem. 2001; 73: 2836-2842Google Scholar, 13.Larsen M.R. Larsen P.M. Fey S.J. Roepstorff P. Characterization of differently processed forms of enolase 2 from Saccharomyces cerevisiae by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.Electrophoresis. 2001; 22: 566-575Google Scholar, 14.Stewart I.I. Thomson T. Figeys D. 18O labeling: a tool for proteomics.Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001; 15: 2456-2465Google Scholar). Structural biologists often employ 15N media, in which all 14N atoms are replaced by 15N, to determine phase shifts in NMR studies. Lahm and Langen (15.Lahm H.W. Langen H. Mass spectrometry: a tool for the identification of proteins separated by gels.Electrophoresis. 2000; 21: 2105-2114Google Scholar) and subsequently Chait and co-workers (16.Oda Y. Huang K. Cross F.R. Cowburn D. Chait B.T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 6591-6596Google Scholar) used this 15N-substituted medium for the purpose of quantifying differences between states of microorganisms. The former group used MALDI and 2D gel electrophoresis to quantify the abundance of mixed spots in 2D gels of bacterial proteins, whereas the latter group quantified relative differences in phosphopeptide abundance in yeast. Although clearly showing the power of stable isotope labeling, the particular method employed was limited in its wider applications; 15N-substituted media are difficult and expensive to make for mammalian systems, so the method has generally been limited to microorganisms that can be grown in these media. Additionally, the degree of incorporation is not necessarily 100%, and because there are varying numbers of nitrogen atoms in the different amino acids, automated interpretation of the resulting spectra has proven difficult. Smith and co-workers (17.Veenstra T.D. Martinovic S. Anderson G.A. Pasa-Tolic L. Smith R.D. Proteome analysis using selective incorporation of isotopically labeled amino acids.J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000; 11: 78-82Google Scholar) have used fourier transform-ion cyclotron resonance (FTICR) measurements of intact proteins from microorganisms that were labeled with deuterated leucine-containing media. In this way the number of leucines could be estimated, which helped in the assignment of protein identity to a measured molecular weight (17.Veenstra T.D. Martinovic S. Anderson G.A. Pasa-Tolic L. Smith R.D. Proteome analysis using selective incorporation of isotopically labeled amino acids.J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000; 11: 78-82Google Scholar). In 1999 Aebersold and co-workers (18.Gygi S.P. Rist B. Gerber S.A. Turecek F. Gelb M.H. Aebersold R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.Nat. Biotechnol. 1999; 17: 994-999Google Scholar) introduced the isotope-coded affinity tag (ICAT) method for relative quantitation of protein abundance. In this approach, an isotopically labeled affinity reagent is attached to particular amino acids in all proteins in the population. After digestion of the protein to peptides, as a necessary step in all mainstream proteomic protocols, the labeled peptides are affinity-purified using the newly incorporated affinity tag, thereby achieving a simplification of the peptide mixture at the same time as incorporating the isotopic label. The method has been applied to a range of problems such as the quantification of microsomal proteins in differentiated versus undifferentiated HL-60 cells (19.Han D.K. Eng J. Zhou H. Aebersold R. Quantitative profiling of differentiation-induced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.Nat. Biotechnol. 2001; 19: 946-951Google Scholar). Limitations of the first iteration of the ICAT principle, which uses biotin as the affinity tag and cysteine as the reactive amino acid, include nonspecific binding to the streptavidin affinity matrix and multiple subsequent reactions at the same site. In recent improvements to the ICAT methodology the cysteines are reacted to solid beads, and a labeled amino acid is attached to the cysteine (20.Zhou H. Ranish J.A. Watts J.D. Aebersold R. Quantitative proteome analysis by solid-phase isotope tagging and mass spectrometry.Nat. Biotechnol. 2002; 20: 512-515Google Scholar). This method addresses many of the above limitations and leads to a larger number of identifications of cysteine-containing peptides. However, the method is performed by cross-linking peptides to beads via their cysteine groups and photo-releasing them afterward, which may compromise low level analysis. A number of similar isotopic labeling techniques have recently been proposed that share the requirement of chemical modification of the peptides or proteins (21.Munchbach M. Quadroni M. Miotto G. James P. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotopic N-terminal labeling of peptides with a fragmentation-directing moiety.Anal. Chem. 2000; 72: 4047-4057Google Scholar, 22.Cagney G. Emili A. De novo peptide sequencing and quantitative profiling of complex protein mixtures using mass-coded abundance tagging.Nat. Biotechnol. 2002; 20: 163-170Google Scholar, 23.Goodlett D.R. Keller A. Watts J.D. Newitt R. Yi E.C. Purvine S. Eng J.K. von Haller P. Aebersold R. Kolker E. Differential stable isotope labeling of peptides for quantitation and de novo sequence derivation.Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001; 15: 1214-1221Google Scholar). Some of these strategies couple the labeling and peptide selection step as in the ICAT method, whereas others decouple these two steps or do not include the affinity step (24.Regnier F.E. Riggs L. Zhang R. Xiong L. Liu P. Chakraborty A. Seeley E. Sioma C. Thompson R.A. Comparative proteomics based on stable isotope labeling and affinity selection.J. Mass Spectrom. 2002; 37: 133-145Google Scholar). For quantitation of phosphorylated proteins, labeling and affinity procedures targeting the phosphogroup directly have also been proposed (25.Oda Y. Nagasu T. Chait B.T. Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for probing the phosphoproteome.Nat. Biotechnol. 2001; 19: 379-382Google Scholar, 26.Zhou H. Watts J.D. Aebersold R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.Nat. Biotechnol. 2001; 19: 375-378Google Scholar, 27.Goshe M.B. Conrads T.P. Panisko E.A. Angell N.H. Veenstra T.D. Smith R.D. Phosphoprotein isotope-coded affinity tag approach for isolating and quantitating phosphopeptides in proteome-wide analyses.Anal. Chem. 2001; 73: 2578-2586Google Scholar). In this report, we describe a stable isotope labeling strategy that we term SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture). Labeled, essential amino acids are added to amino acid deficient cell culture media and are therefore incorporated into all proteins as they are synthesized, “encoded into the proteome.” No chemical labeling or affinity purification steps are performed, and the method is compatible with virtually all cell culture conditions, including primary cells. We show that incorporation is complete and that cells remain normal in the presence of labeled media. The method is convenient and inexpensive and is used widely in our laboratory. As an example, we applied SILAC to the study of mouse C2C12 cells as they differentiate from myoblasts into myotubes. This process of muscle differentiation necessarily involves broad changes in the expression levels of proteins as the cells differentiate from one cell type to another. Several proteins were found to be up-regulated during this process; most of these have not been described previously as up-regulated proteins in this model of muscle differentiation. SILAC requires living cells but may be advantageous over other quantitative proteomics techniques whenever cell culture is used. The base medium, Eagle’s minimum essential medium (with Earle’s salts and deficient in l-leucine, l-lysine, and l-methionine) was obtained from Sigma (catalog number M 7270). The liquid medium was reconstituted according to the manufacturer’s instructions. Briefly, the powdered medium was dissolved in water, together with 2.2 g/liter sodium bicarbonate, and the pH was adjusted to 7.4. The amino acids l-lysine and l-methionine were prepared as 1000× stock solutions in phosphate-buffered saline and added to the dissolved media to give a final concentration of 72.5 and 15 mg/liter, respectively. The medium was filtered through a 0.22-μm filter to obtain sterile, complete medium deficient only in l-leucine. For labeling experiments, l-leucine or deuterium-labeled l-leucine-5,5,5-D3, 99 atom % D (Isotec, Miamisburg, OH) were prepared as 250× stock solutions in phosphate-buffered saline, sterile filtered, and added to the media for a final concentration of 52 mg/liter. NIH 3T3 and C2C12 cells were grown in Eagle’s minimum essential medium supplemented with 2 mm l-glutamine and 10% dialyzed fetal bovine serum plus antibiotics in a humidified atmosphere with 5% CO2 in air. Cell lines were grown for six cell divisions in labeling media containing either normal leucine or Leu-d3 before the start of differentiation. Undifferentiated C2C12 cells (day 0) were grown to confluence in normal leucine (Leu-d0) media. C2C12 cells that were used for myotube differentiation were grown in Leu-d3 media and were harvested over the course of differentiation (days 0, 2, and 5). To induce differentiation, the amount of dialyzed serum in the Leu-d3-containing media was decreased to 2%. Growth medium was replaced with fresh medium every 2 days over a period of 5 days. For mixing experiments, NIH 3T3 fibroblasts were washed twice with phosphate-buffered saline to remove serum proteins and then scraped in a lysis buffer containing 1% SDS, 1% Nonidet P-40, 50 mm Tris, pH 7.5, 150 mm NaCl and protease inhibitors (Complete™ tablets; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). The lysate was sonicated for two cycles of 30 s each and centrifuged to pellet cellular debris. Protein quantitation was performed using the Bradford protein assay, and mixtures of lysates were combined in protein concentration ratios of 1:1, 1:3, and 1:10 (Leu-d0:Leu-d3). For the relative quantitation of protein expression during muscle differentiation of C2C12 myoblasts, cell lysates from different stages (days 0, 2, and 5) were prepared as described above. After determination of protein concentration with the Bradford assay, mixtures of Leu-d0- and -d3-labeled samples were prepared in the following manner: an undifferentiated Leu-d0 at day 0 was mixed with an equal amount of protein from Leu-d3-labeled samples at days 0, 2, and 5. Protein mixtures were resolved on a 10% SDS-PAGE gel and silver-stained to visualize the gel bands. Gel bands were excised and subjected to in-gel reduction, alkylation, and tryptic digestion as described previously (28.Shevchenko A. Wilm M. Vorm O. Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.Anal. Chem. 1996; 68: 850-858Google Scholar, 29.Pandey A. Andersen J.S. Mann M. Use of mass spectrometry to study signaling pathways.Sci. STKE. 2000; 2000: PL1Google Scholar). MALDI data were obtained with a Bruker Reflex III (Bruker Daltonics) and a Voyager DE-STR (Applied Biosystems) with α-cyanohydroxycinnamic acid as the matrix. For nanoelectrospray experiments (30.Wilm M. Shevchenko A. Houthaeve T. Breit S. Schweigerer L. Fotsis T. Mann M. Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry.Nature. 1996; 379: 466-469Google Scholar), digests were desalted and concentrated on a microcolumn packed into GELoader tips (31.Gobom J. Nordhoff E. Mirgorodskaya E. Ekman R. Roepstorff P. Sample purification and preparation technique based on nano-scale reversed-phase columns for the sensitive analysis of complex peptide mixtures by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.J. Mass Spectrom. 1999; 34: 105-116Google Scholar). Peptides were eluted with 50% methanol in 5% formic acid directly into a nanospray needle, and the eluate subjected to MS and MS/MS analysis on a QSTAR Pulsar quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (ABI/MDS-Sciex, Toronto, Canada) and equipped with a nanoelectrospray ion source (Protana Engineering A/S, Odense, Denmark). Proteins were identified by searching peptide sequence tags (32.Mann M. Wilm M.S. Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags.Anal. Chem. 1994; 66: 4390-4399Google Scholar), derived from fragment ion spectra of selected peptides, against the non-redundant protein database maintained and updated regularly at the European Bioinformatics Institute (EBI; Hinxton, United Kingdom) using the PepSea software package (MDS Proteomics A/S, Odense, Denmark). For determining quantitative ratios in cases where the Leu-d0 and Leu-d3 isotope distributions overlapped an isotopic correction factor was applied as follows: after peptide identification, the peptide sequence was submitted to the web-based tool MS-Isotope, which is part of the ProteinProspector package (prospector.ucsf.edu). The isotope pattern of the lower mass in the isotope pair was then subtracted from the full isotope pattern to obtain the correct peak heights of the higher mass peptide. Mammalian cells cannot synthesize a number of amino acids, therefore these “essential” amino acids must be supplied in cell culture medium as free amino acids for the medium to support cell growth. Isotopically labeled analogs of these amino acids can be synthesized and are available commercially. If the labeled analog of an amino acid is supplied instead of the natural abundance amino acid, it will be incorporated into each newly synthesized protein chain. After a certain number of cell doublings, each instance of this particular amino acid will have been replaced by its isotopically labeled analog. If there is no chemical difference between the labeled amino acid and the natural amino acid, the cells should behave exactly like a control cell population grown with the normal amino acid. This is illustrated in Fig. 1. The experimental cell population can then be treated in a specific way, such as differentiation induction or cytokine stimulation, for example. Protein populations from both samples are then harvested, and because the label is encoded directly into the amino acid sequence of every protein, the extracts can be mixed directly. Purified proteins or peptides will preserve the exact ratio of the labeled to unlabeled protein, as no more synthesis is taking place, and therefore no scrambling can take place at the amino acid level. The proteins and peptides can then be analyzed in any of the ways in which they are analyzed in non-quantitative proteomics. Quantitation takes place at the level of the peptide mass spectrum or peptide fragment mass spectrum, exactly the same as in any other stable isotope method (such as ICAT). It is important to note that the absence of chemical steps implies the same sensitivity and throughput for SILAC as for non-quantitative methods. Fig. 1 also contrasts SILAC with ICAT labeling, which is perhaps the most well established and representative method in quantitative proteomics by mass spectrometry. As can be seen from the figure, proteins need to be reduced and alkylated before mixing, steps that can make it difficult to maintain the samples in directly comparable states during multiple fractionation steps. Furthermore, the chemical modification and affinity purification step can be difficult to perform with very small amounts of sample, and non-cysteine-containing peptides are also sometimes bound to the avidin column. Finally, in cases of extensive fractionation, a large number of affinity purifications needs to be performed for a single experiment. One further difference between SILAC (using leucine) and ICAT methods is that SILAC differentially labels more than half of the tryptic peptides whereas ICAT only labels somewhat more than 20%. This calculation is based on the 2 and 10% relative abundance of cysteine and leucine, respectively, and an average length of 14 amino acids for tryptic peptides that can be sequenced by mass spectrometry. Conversely, ICAT achieves some decrease in complexity of the peptide mixture whereas SILAC does not change the peptide abundances resulting from a digest. Because the reduction in complexity in the case of ICAT is based on the ability to label cysteine residues, one is unable to detect non-cysteine-containing proteins at all. Fragmentation patterns in ICAT are influenced by the functional group attached to the cysteine whereas in SILAC they are the same as for the unlabeled peptide (see below). We made use of a commercially available labeling medium deficient in certain amino acids, specifically, methionine, lysine, and most importantly for our purposes, leucine. Our goal was to replenish the normal amino acids with the exception of the leucine, which would be labeled with deuterium (l-leucine-5,5,5-D3; Leu-d3). We chose leucine in these experiments, because it is the most abundant amino acid, allows distinction between isoleucine and leucine, and is readily available. Other essential amino acids could have been used, as well. Because mammalian cells require serum-containing media for their optimal growth, free amino acids present in the serum can be taken up by the cells. To circumvent this issue, we used commercially available dialyzed serum instead of normal serum as it does not contain detectable amounts of free amino acids. To illustrate the importance of this, we grew cells in our deficient media with Leu-d3 but supplemented with normal fetal calf serum in place of the dialyzed serum. Fig. 2 clearly shows that proteins incorporate normal leucine whose only source can be the undialyzed serum. Without complete incorporation of Leu-d3 in proteins, accurate quantitation of labeled and unlabeled cells will not be possible. In the experiments we present here, we have used a commercially available powdered Eagle’s minimal essential medium formulation supplemented with the essential amino acids methionine, lysine, and leucine. Extra costs incurred by SILAC compared with non-isotopic methods are related mainly to the costs of the amino acid used but are generally not a large fraction of the cost of the experiment. The SILAC method does not require specialized handling in cell culture beyond the preparation of media that we then find generally applicable to a variety of cell lines and systems that we have tested in our laboratory. For example, we have successfully grown several other cell lines including a human cervical carcinoma cell line (HeLa), Chinese hamster ovary epitheloid cells (CHO-K1), African green monkey kidney fibroblastic cells (COS-7), and a rat pheochromocytoma suspension cell line (PC12) in d3-labeled culture media (data not shown), demonstrating the general applicability of this method to any cell culture-based system. We performed a time course experiment to establish the minimum time required for cells to incorporate Leu-d3 fully in all proteins. The cells were grown in Leu-d3-containing medium for different lengths of time. As shown in Fig. 3, incorporation of Leu-d3 was detectable in peptides after 12 h of growth. A larger incorporation of Leu-d3 was observed at later time points with full incorporation by day 5. This corresponds to approximately five doublings for NIH 3T3 fibroblasts used in this experiment indicating that cell lines can be rapidly adapted for use in similar experiments to quantitate protein levels. It should be noted that in the time for the cells to reach five doublings, even those proteins with very long half-lives would still show ∼97% (1–0.55) incorporation of the label as the growing cells synthesize new protein to fill their required complement. We were able to identify proteins by both MALDI-TOF peptide mass fingerprinting, as well as through directed peptide sequencing experiments with MS/MS. In instances where mixtures of Leu-d0- and -d3-labeled samples were analyzed, the identification of leucine-containing peptides was facilitated by the characteristic doublets of peak clusters present in the mass spectra. From the MS spectra, we were able to confirm these doublets were actual Leu-d0 and -d3 peak clusters by comparing the spectra containing both Leu-d0 and -d3 peptides to a sample containing a single species. Using MS/MS, as seen in Fig. 4B, the similar fragmentation patterns from Leu-d0 and -d3 peptides can also help to confirm the identity of matched quantitation pairs. In peptide mass fingerprinting, the presence of Leu-d3 in peptides gave increased confidence when matching peptides (i.e. peptides putatively containing a single leucine residue should have their peptide masses shifted by 3 Da, and those with more labeled residues would have their mass shifted by the corresponding amount). It was possible to identify and quantitate protein levels based on matched Leu-d0 and -d3 peptides in MALDI. However, the mixtures of proteins present in a one-dimensional SDS-PAGE, as well as the additional peaks arising from the two cell states, complicated the process of protein identification by peptide mass fingerprinting. As such, we did the majority of our mass spectrometric analyses by nanoelectrospray mass spectrometry. Fragmentation spectra of Leu-d0 and Leu-d3-containing peptides were largely identical except for the characteristic mass shift of fragments containing the leucine residue. These shifts in fragment masses would lend additional specificity to the assignment of peptide sequence tags. This is similar in principle to previous work (8.Shevchenko A. Chernushevich I. Standing K.G. Thompson B. Wilm M. Mann M. Rapid “de novo” peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997; 11: 1015-1024Google Scholar, 10.Uttenweiler-Joseph S. Neubauer G. Christoforidis S. Zerial M. Wilm M. Automated de novo sequencing of proteins using the differential scanning technique.Proteomics. 2001; 1: 668-682Google Scholar) where incorporation of 18O in tryptic peptides led to a characteristic doublet that greatly helps in obtaining sequence tag information. A mixing experiment was performed using known volumes of cell lysate from NIH 3T3 cells. Lysates were mixed in ratios of 1:1, 1:3, and 1:10 (Leu-d0:Leu-d3). The ratios of peak heights of different leucine-containing peptides were found to be consistent in the proteins analyzed (β-actin A-X and α-enolase). Fig. 4A gives examples of two peptides mixed in the ratio 1:3; in both cases observed ratios are similar to expected ratios. We also performed the reverse mixing experiment (data not shown). With correction for the isotopic overlap in peptides containing one leucine only (see “Experimental Procedures”), the expected ratios were obtained again. In some instances, we observe some consistent errors in quantitating higher -fold differences (i.e. greater than 6×). We believe this to be a function of the complexity of the peptide mixture present in a 1D gel band and to be complicated further by nanoelectrospray analyses that did not provide an additional step of peptide separation. Peptide separation by chromatography would remove this problem. To address this problem using nanoelectrospray, we tried to compare the relative intensities of fragment ions in the MS/MS spectra obtained from Leu-d0 and Leu-d3 samples. As shown in Fig. 4B, the observed ratios from the relative intensities from all the fragment peaks compare well with the expected ratio of 1:10. The ratios for a selection of peaks are shown in Table I. It is important to note that the fragmentation patterns in labeled and unlabeled peptides are identical, and no complicating features are introduced because of the presence of a label.Table 1Quantitation of peptides by their fragmentsIonPeptide labelm/zIntensityObserved ratiob2Leu-d0171.112710.0Leu-d3171.11264y5Leu-d0568.32439.1Leu-d3571.32221y6Leu-d0639.411711.1Leu-d3642.41297y10Leu-d01095.61910.8Leu-d31104.6206 Open table in a new tab To test whether we could identify proteins involved in cellular processes based on quantitative changes in their abundance, we used murine C2C12 cells that have been widely used as an in vitro model system for muscle differentiation (33.Galbiati F. Volonte D. Engelman J.A. Scherer P.E. Lisanti M.P. Targeted down-regulation of caveolin-3 is sufficient to inhibit myotube formation in differentiating C2C12 myoblasts. Transient activation of p38 mitogen-activated protein kinase is required for induction of caveolin-3 expression and subsequent myotube formation.J. Biol. Chem. 1999; 274: 30315-30321Google Scholar, 34.Odelberg S.J. Kollhoff A. Keating M.T. Dedifferentiation of mammalian myotubes induced by msx1.Cell. 2000; 103: 1099-1109Google Scholar, 35.Jehn B.M. Dittert I. Beyer S. von Der Mark K. Bielke W. c-Cbl binding and ubiquitin-dependent lysosomal degradation of membrane-associated Notch1.J. Biol. Chem. 2002; 277: 8033-8040Google Scholar). Although extensively studied, the process of myogenesis is not understood completely. The conversion of myoblasts to myotubes can be characterized by three major steps, withdrawing the progenitor cells from the cell cycle, expression of muscle-specific genes, and fusion of these cells leading to formation of multinuclear myotubes (36.Dominov J.A. Dunn J.J. Miller J.B. Bcl-2 expression identifies an early stage of myogenesis and promotes clonal expansion of muscle cells.J. Cell Biol. 1998; 142: 537-544Google Scholar). Fig. 5A shows light microscopy pictures of the dramatic morphologic changes that these cells undergo as they differentiate when cultured in a medium low in mitogens. To quantitate changes in protein levels, we grew the uninduced set of cells in normal medium and allowed the cells growing in Leu-d3-containing medium to differentiate. Cell lysates were harvested at different time points and analyzed to determine the identity and change in abundance of the differentially expressed proteins. As noted above, the process of myotube formation is accompanied by substantial alterations in cell shape, morphology, and function because of combined changes in expression levels of extracellular matrix components, intracellular proteins, and nuclear factors (36.Dominov J.A. Dunn J.J. Miller J.B. Bcl-2 expression identifies an early stage of myogenesis and promotes clonal expansion of muscle cells.J. Cell Biol. 1998; 142: 537-544Google Scholar, 37.Melo F. Carey D.J. Brandan E. Extracellular matrix is required for skeletal muscle differentiation but not myogenin expression.J. Cell. Biochem. 1996; 62: 227-239Google Scholar). To demonstrate the SILAC concept we tested whether differential protein expression could be measured in this system. For analysis, we chose a combination of 1D gel electrophoresis with nanoelectrospray mass spectrometry. Lysates from different time points were separated by gel electrophoresis and Coomassie- or silver-stained (see Fig. 5B). As expected, the 1D gel traces of total lysates contained few distinct features. Five bands were excised in regions of the lane containing mixed Leu-d0/Leu-d3 sample, which in separate lanes with unmixed samples had shown differential staining between day 0 and other time points. A total of nine proteins were quantified in these bands. It was possible to obtain consistent ratios in different leucine-containing peptides for the same protein. The process of quantitation was sometimes complicated by the complexity of the MS spectrum because of the large number of protein species found in the protein mixture used for nanoelectrospray analysis. In such cases, we strove to base our quantitation on peptide sets that were well separated and free from interfering peaks. A correction factor for isotopic overlap was applied if necessary (see “Experimental Procedures”). The protein quantitation data are represented by histograms in Fig. 6. Not surprisingly, expression of several glucose metabolism-related enzymes was up-regulated on days 2 and 5 of muscle differentiation relative to day 0. For example, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase level increased by ∼4-fold. The level of M2 isozyme of pyruvate kinase increased by nearly 2-fold, which correlates with the observation that the M1 and M2 isozymes are more highly expressed in skeletal muscle than in other tissues (38.Kawachi I. Tanaka K. Tanaka M. Tsuji S. Dendritic cells presenting pyruvate kinase M1/M2 isozyme peptide can induce experimental allergic myositis in BALB/c mice.J. Neuroimmunol. 2001; 117: 108-115Google Scholar). Protein synthesis-related factors such as ribosomal proteins were also found to be up-regulated up to 2.5-fold, again in accordance with increased protein synthesis during the conversion process. Levels of fibronectin, one of the major components of extracellular matrix and essential for myogenesis, were also found to be up-regulated. Although fibronectin is known to be an essential factor in muscle cell differentiation (37.Melo F. Carey D.J. Brandan E. Extracellular matrix is required for skeletal muscle differentiation but not myogenin expression.J. Cell. Biochem. 1996; 62: 227-239Google Scholar, 39.Serini G. Bochaton-Piallat M.L. Ropraz P. Geinoz A. Borsi L. Zardi L. Gabbiani G. The fibronectin domain ED-A is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factor-β1.J. Cell Biol. 1998; 142: 873-881Google Scholar), it had not been shown previously to be up-regulated during this process. The relative levels of other proteins in Fig. 6 such as annexin II were seen to remain essentially constant over the course of differentiation, thus serving as an effective internal control. Our experiments have shown that the process of quantitation of protein levels by SILAC can be performed using standard equipment and procedures available in most proteomics laboratories today and can be rapidly adopted by research groups equipped with cell culture facilities. Although we have demonstrated here the compatibility of the method with gel electrophoresis and nanoelectrospray mass spectrometry, the higher throughputs in quantitative analysis and protein identification afforded by liquid chromatography MS/MS approaches are certain to enhance the utility of this method.

Human Protein Reference Database (HPRD) is an object database that integrates a wealth of information relevant to the function of human proteins in health and disease. Data pertaining to thousands of protein-protein interactions, posttranslational modifications, enzyme/substrate relationships, disease associations, tissue expression, and subcellular localization were extracted from the literature for a nonredundant set of 2750 human proteins. Almost all the information was obtained manually by biologists who read and interpreted >300,000 published articles during the annotation process. This database, which has an intuitive query interface allowing easy access to all the features of proteins, was built by using open source technologies and will be freely available at http://www.hprd.org to the academic community. This unified bioinformatics platform will be useful in cataloging and mining the large number of proteomic interactions and alterations that will be discovered in the postgenomic era.

Abstract

 Background: The nucleolus is a subnuclear organelle containing the ribosomal RNA gene clusters and ribosome biogenesis factors. Recent studies suggest it may also have roles in RNA transport, RNA modification, and cell cycle regulation. Despite over 150 years of research into nucleoli, many aspects of their structure and function remain uncharacterized. Results: We report a proteomic analysis of human nucleoli. Using a combination of mass spectrometry (MS) and sequence database searches, including online analysis of the draft human genome sequence, 271 proteins were identified. Over 30% of the nucleolar proteins were encoded by novel or uncharacterized genes, while the known proteins included several unexpected factors with no previously known nucleolar functions. MS analysis of nucleoli isolated from HeLa cells in which transcription had been inhibited showed that a subset of proteins was enriched. These data highlight the dynamic nature of the nucleolar proteome and show that proteins can either associate with nucleoli transiently or accumulate only under specific metabolic conditions. Conclusions: This extensive proteomic analysis shows that nucleoli have a surprisingly large protein complexity. The many novel factors and separate classes of proteins identified support the view that the nucleolus may perform additional functions beyond its known role in ribosome subunit biogenesis. The data also show that the protein composition of nucleoli is not static and can alter significantly in response to the metabolic state of the cell.

Summary

 To elucidate the role of Tau isoforms and post-translational modification (PTM) stoichiometry in Alzheimer's disease (AD), we generated a high-resolution quantitative proteomics map of 95 PTMs on multiple isoforms of Tau isolated from postmortem human tissue from 49 AD and 42 control subjects. Although Tau PTM maps reveal heterogeneity across subjects, a subset of PTMs display high occupancy and frequency for AD, suggesting importance in disease. Unsupervised analyses indicate that PTMs occur in an ordered manner, leading to Tau aggregation. The processive addition and minimal set of PTMs associated with seeding activity was further defined by analysis of size-fractionated Tau. To summarize, features in the Tau protein critical for disease intervention at different stages of disease are identified, including enrichment of 0N and 4R isoforms, underrepresentation of the C terminus, an increase in negative charge in the proline-rich region (PRR), and a decrease in positive charge in the microtubule binding domain (MBD).

The mass spectrometric analysis of protein phosphorylation is still far from being routine, and the outcomes thereof are often unsatisfying. Apart from the inherent problem of substoichiometric phosphorylation, three arguments as to why phosphorylation analysis is so problematic are often quoted, including (a) increased hydrophilicity of the phosphopeptide with a concomitant loss during the loading onto reversed-phase columns, (b) selective suppression of the ionization of phosphopeptides in the presence of unmodified peptides, and (c) lower ionization/detection efficiencies of phosphopeptides as compared with their unmodified cognates. Here we present the results of a study investigating the validity of these three arguments when using electrospray ionization mass spectrometry. We utilized a set of synthetic peptide/phosphopeptide pairs that were quantitated by amino acid analysis. Under the applied conditions none of the experiments performed supports the notions of (a) generally increased risks of losing phosphopeptides during the loading onto the reversed-phase column because of decreased retention and (b) the selective ionization suppression of phosphopeptides. The issue of ionization/detection efficiencies of phosphopeptides versus their unphosphorylated cognates proved to be less straightforward when using electrospray ionization because no evidence for decreased ionization/detection efficiencies for phosphopeptides could be found. The mass spectrometric analysis of protein phosphorylation is still far from being routine, and the outcomes thereof are often unsatisfying. Apart from the inherent problem of substoichiometric phosphorylation, three arguments as to why phosphorylation analysis is so problematic are often quoted, including (a) increased hydrophilicity of the phosphopeptide with a concomitant loss during the loading onto reversed-phase columns, (b) selective suppression of the ionization of phosphopeptides in the presence of unmodified peptides, and (c) lower ionization/detection efficiencies of phosphopeptides as compared with their unmodified cognates. Here we present the results of a study investigating the validity of these three arguments when using electrospray ionization mass spectrometry. We utilized a set of synthetic peptide/phosphopeptide pairs that were quantitated by amino acid analysis. Under the applied conditions none of the experiments performed supports the notions of (a) generally increased risks of losing phosphopeptides during the loading onto the reversed-phase column because of decreased retention and (b) the selective ionization suppression of phosphopeptides. The issue of ionization/detection efficiencies of phosphopeptides versus their unphosphorylated cognates proved to be less straightforward when using electrospray ionization because no evidence for decreased ionization/detection efficiencies for phosphopeptides could be found. Protein phosphorylation is one of the most prevalent intracellular protein modifications that is of pivotal importance in numerous cellular processes including cell differentiation, proliferation, and migration. It is estimated that ∼30% of all proteins in a cell are phosphorylated at any given time. However, this number is in stark contrast to the actual number of phosphorylation sites found so far. For instance, the Phospho.ELM database (phospho.elm.eu.org) currently lists 1703 experimentally verified phosphorylation sites for 556 different proteins derived from eukaryotes, the human protein reference database (www.hprd.org) lists 3652 reported phosphorylation sites on 1240 human proteins, and PhosphoSite (www.phosphosite.org) lists 6084 non-redundant phosphorylation sites on 2430 human and mouse proteins. However, a recent study by Beausoleil et al. (1Beausoleil S.A. Jedrychowski M. Schwartz D. Elias J.E. Villen J. Li J. Cohn M.A. Cantley L.C. Gygi S.P. Large-scale characterization of HeLa cell nuclear phosphoproteins.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 12130-12135Google Scholar) gave some idea about the expected number of phosphorylation in the cell when the authors performed a large scale phosphoproteomics study on HeLa cell nuclei. Although their method was biased against basic phosphopeptides where His, Lys-Pro, and/or Arg-Pro residues are in close proximity to the phosphoamino acid residue, more than 2000 phosphorylation sites on 967 nuclear proteins were found. Considering the fact that protein phosphorylation analysis is of major interest in numerous laboratories around the world it is surprising that more information about protein phosphorylation sites has not been gathered since the discovery of protein phosphorylation. This raises the question as to why it is still such a challenge to perform unbiased protein phosphorylation analysis. One inherent reason is the generally low phosphorylation stoichiometry of most of the proteins such that phosphopeptides are grossly underrepresented in the generated complex peptide mixtures (see below). In addition, numerous reasons can be listed for not being able to identify and localize a phosphorylation site in a given protein, which affects all stages of phosphorylation analysis, i.e. sample preparation, analysis, and data interpretation. Examples for problems during the sample preparation include e.g. omission of phosphatase inhibitor, overestimation of the degree of phosphorylation because of the lack of information about the phosphorylation stoichiometry when using phosphospecific antibodies, and/or underestimation of the heterogeneity of the phosphorylation due to nonspecific 32P-labeling. However, even if it was ensured that a particular protein sample is phosphorylated by using other methods such as radiolabeling it is often the case that the mass spectrometric analysis does not provide any information about the sites of phosphorylation. Three main reasons are commonly used to explain as to why the phosphopeptides were missed during the mass spectrometric analysis: (i) increased hydrophilicity and hence reduced retention of phosphopeptides on reversed-phase materials, (ii) selective suppression of their ionization/detection efficiencies in the presence of large amounts of unphosphorylated peptides, and (iii) lower detection efficiencies of phosphopeptides as compared with their unphosphorylated cognates. In this study we tried to scrutinize these different arguments often brought forward with the aim to draw the attention to the most prevalent problem(s) of mass spectrometric phosphorylation analysis and to improve the analysis where it is most fruitful/promising. All solvents used were of HPLC-grade quality from Burdick and Jackson (VWR International). All chemicals were purchased from Sigma unless otherwise noted. The synthetic peptides were HPLC-purified and quantitated in duplicate by amino acid analysis. Stock solutions were prepared using freshly calibrated pipettes. The phosphopeptide and its unphosphorylated counterpart were mixed in at least two different defined ratios (final concentrations 30–150 nm). To avoid carry-over problems during the LC/MS analyses, the solutions of two different peptide pairs were analyzed in an alternating fashion. The standard protein digest was prepared by digesting 50 μm protein solution overnight at 37 °C using sequencing grade trypsin (w/w 1:10, Roche Biochemicals). All electrospray ionization experiments were performed using a QSTAR XL hybrid mass spectrometer (AB/MDS Sciex) hyphenated with microscale capillary reversed-phase HPLC (Famos autosampler (LC Packings), Agilent 1100 HPLC pump (Agilent)). The columns were packed in-house using Magic C18 (5 μm, 200 Å, Michrom BioResources) beads. The buffer compositions are as follows: buffer A: 2.5% acetonitrile, 0.2% formic acid; buffer B: 2.5% H2O, 0.2% formic acid. For the quantitation experiments a 5-min gradient was used with mass spectra being acquired every 0.15 s. Data analysis and quantitation was done using the Analyst software package provided by Applied Biosystems/MDS Sciex. “Phosphopeptides often are lost during the loading onto the reversed-phase columns because the addition of anionic/acidic phosphate groups increases hydrophilicity resulting in reduced retention.” This is one reason often used to explain why a phosphorylation analysis using LC/MS failed. To test this we used a set of peptide/phosphopeptide pairs that varied in length from 7 to 17 amino acids, resembling the size of peptides commonly observed in tryptic digests. Cysteine and methionine-containing peptides were not included in this study to avoid problems associated with partial oxidation. All peptide pairs were analyzed using water/acetonitrile/0.2% formic acid buffers as mobile phases and Magic C18 as stationary phase; Magic C18 is a reversed-phase material commonly used in proteomics applications. Interestingly, despite the common belief that phosphopeptides are more hydrophilic than their unphosphorylated cognate, all singly phosphorylated peptides tested eluted off the reversed-phase column after the unmodified complement irrespective of the number of basic amino acid residues (His, Lys, Arg; Table I). One example is presented in Fig. 1A; it shows the selected ion chromatograms (XICs) 1The abbreviation used is: XIC, selected ion chromatogram. of RNYSVGS and RNYpSVGS Table I, Peptide species 2), the shortest peptide/phosphopeptide pair investigated. Although there is a considerable overlap in the elution profiles, the phosphopeptide clearly elutes after the unphosphorylated cognate. Of the three doubly phosphorylated peptides in this test set, two phosphopeptides eluted significantly later than the singly phosphorylated or unphosphorylated peptide from the reversed-phase column; one example is shown in Fig. 1B. The third doubly phosphorylated peptide with the sequence DQAVpTEpYVATR Table I, Peptide species 27) was the only peptide whose modified form eluted before its unmodified complement (Fig. 1C). It was noted that this particular peptide was the only phosphopeptide in our sample set in which the number of phospho moieties exceeded the number of basic amino acid residues. This led us to hypothesize that phosphorylation does increase the hydrophilicity of peptides; however, if the peptide contains basic amino residues that are positively charged under standard LC(MS) conditions, the increase of hydrophilicity can be overcompensated by charge neutralization, i.e. reduction of the net charge, thereby reducing the overall hydrophilicity.Table ITest peptidesPeptide speciesPeptide sequenceZΔRTIon./detec. efficiency ratiomin1LLLRLpSENSG2++ 0.11.4 (0.13)2RNYpSVGS2++ < 0.051.08 (0.074)3IVADQpTPTPTRF2++ < 0.050.28 (0.021)4FDSLPSpSPSSATPH2++ < 0.051.74 (0.099)5GAHFpSVSSLAE2++ 0.31.7 (0.034)6IGRRQpSLIEDA2++ < 0.050.50 (0.038)73++ < 0.050.86 (0.078)8KTQApSQGTLQTR2++ 0.150.082 (0.006)93++ 0.150.64 (0.076)10LQRQPSSpSPGPTPR2++ < 0.050.93 (0.067)113++ < 0.053.02 (0.12)12LRLSSpSSGRLR2++ 0.10.37 (0.031)133++ 0.10.59 (0.043)14GLGTRTGpSNLDRDKL2++ 0.150.65 (0.053)153++ 0.150.84 (0.093)164++ 0.15650 (320)17KFELLPpTPPLSPSRRSG3++ 0.11.6 (0.24)18KDLKRLFpSGTQISTI2++ 0.250.99 (0.066)193++ 0.251.7 (0.086)204++ 0.25850 (600)21SRARIGpSDPLAYEPK2++ 0.10.79 (0.038)223++ 0.10.88 (0.14)234++ 0.1100 (10)24RYPRPVpSVPPSPSLSR3++ 0.250.52 (0.064)25KRRQIpSIRGIV2++ 0.250.35 (0.031)263++ 0.250.76 (0.028)27DQAVpTEpYVATR2+− 0.152.0 (0.20)28KFELLPpTPPLpSPSRRSG (P vs. ppP)3++ 0.182.3 (0.27)29RYPRPVpSVPPpSPSLSR (P vs. ppP)3++ 0.550.79 (0.088)30KFELLPpTPPLpSPSRRSG (pP vs. ppP)3++ 0.081.5 (0.15)31RYPRPVpSVPPpSPSLSR (pP vs. ppP)3++ 0.31.5 (0.17) Open table in a new tab This means that the introduction of phosphorylation sites can decrease the overall hydrophilicity/increase the retention time under the employed LC conditions as long as the positive net charge decreases. Once the number of phosphorylation sites exceeds the number of basic residues the hydrophilicity increases again whereby the most hydrophobic species are generated when the number of phosphoamino acid residues equals the number of basic amino acid residues, i.e. a net charge of 0 is reached. The hypothesis of charge compensation gained support when the doubly phosphorylated peptide DQAVpTEpYVATR Table I, Peptide species 27) was partially dephosphorylated and the mixture of doubly phosphorylated, singly phosphorylated, and unphosphorylated species was analyzed by LC/MS. The selected ion chromatograms (XIC) of the different species are shown in Fig. 1C. Whereas the doubly phosphorylated peptide (net charge −1) eluted before the unphosphorylated peptide (net charge +1), the singly phosphorylated peptide (net charge 0) eluted after the unphosphorylated peptide. The described elution order can be observed in the absence of strong ion pairing reagents such as trifluoroacetic acid (TFA) as these agents mask the positive charges on peptides, whereas the negative charges on peptides caused by carboxylic groups are neutralized at acidic pH. This is contrasted by peptides with highly acidic functional groups such as phospho moieties for which one negative charge on the phosphate group remains even at pH 2 such that phosphopeptides elute before their unphosphorylated peptide counterparts when ion pairing reagent is present to neutralize the positive charges. Because strong ion pairing reagents such as TFA are often not required (and not desired) in LC/MS experiments the elution order of phosphopeptides and their unmodified cognates are easily modulated. More systematic work is necessary to evaluate the effects of different stationary phases and buffer compositions on the elution order of peptides and their phosphorylated cognates. This notion is underscored by a recently published example of a doubly phosphorylated peptide and its partially phosphorylated/unphosphorylated cognates; in this example, which employed only formic acid without TFA in the LC buffers, the peptides eluted in the following order: monophosphopeptide A < diphosphopeptide < unmodified peptide < monophosphopeptide B (2Ballif B.A. Roux P.P. Gerber S.A. MacKeigan J.P. Blenis J. Gygi S.P. Quantitative phosphorylation profiling of the ERK/p90 ribosomal S6 kinase-signaling cassette and its targets, the tuberous sclerosis tumor suppressors.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 667-672Google Scholar). Such an elution order is hard to rationalize irrespective of the presence or absence of any ion pairing reagents. Nevertheless, the data presented clearly show that phosphorylation does not necessarily lead to an overall increase in hydrophilicity. This is of particular interest for tryptic peptides, which generate peptides with at least one basic amino acid residue (exception: C-terminal peptide) such that singly phosphorylated peptides should elute after the unphosphorylated cognate; this minimizes the risk of losing phosphopeptides during the loading of the reversed-phase column. Multiple phosphorylations, however, can indeed lead to decreased retention if the number of phosphorylation sites is not matched by the number of basic amino acid residues. However, because phosphorylation affects the proteolysis kinetics of cleavage sites proximal to the site of phosphorylation (3Schlosser A. Pipkorn R. Bossemeyer D. Lehmann W.D. Analysis of protein phosphorylation by a combination of elastase digestion and neutral loss tandem mass spectrometry.Anal. Chem. 2001; 73: 170-176Google Scholar), it can be expected that multiply phosphorylated peptides will show an increased frequency of more than one basic amino acid residues, thus partially compensating this problem. Nevertheless, alternative proteolysis strategies should be considered (e.g. Lys-C) which (a) increase the average number of basic residues within the proteolytic peptides and/or (b) increase the length of the proteolytic peptides, which generally also increases the retention time, thus reducing the potential loss of phosphopeptides during the loading of the reversed-phase column. That said, the loss of phosphopeptides because of increased hydrophilicity can be a serious problem if nonspecific proteases are used generating small peptides without any basic amino acid residues. This notion was confirmed when a highly acidic and hydrophilic peptide/phosphopeptide pair with the sequence EDADS(pY)ENMD was analyzed by LC/MS; whereas the unmodified form of the peptide was retained on the C18 column, the phosphorylated cognate was detected in the flow through under standard LC/MS conditions. “Phosphorylated species are selectively suppressed in the presence of unmodified peptides” is another often used general statement that is made without detailed examination of this phenomenon. To test the validity of this generalization for LC/MS, constant amounts of several synthetic phosphopeptides and their unphosphorylated cognates were mixed with increasing amounts of a tryptic BSA digest, ranging from equal amount to 100-fold excess. The ratios of the signal intensities of peptide versus phosphopeptide were calculated for each pair and are shown in Fig. 2A. It is evident from the almost horizontal curves that there is no significant change in the relative ionization/detection efficiencies with increasing “background” of unmodified peptides. To ensure that this observation is valid not only for this particular set of peptides/phosphopeptides and tryptic BSA digest, another set of six different phosphopeptide/peptide pairs was spiked into seven individual tryptic digest of numerous commercially available proteins: (ubiquitin (8.5 kDa), avidin (17 kDa), α-casein (25 kDa), β-casein (25 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa), alcohol dehydrogenase (40 kDa), ovalbumin (43 kDa)) and into a mixture thereof. This mixture simulated the digest of a ∼200 kDa protein. The normalized signal intensity ratios for the different peptide/phosphopeptide pairs present in those samples are shown in Fig. 2B. The horizontal trend of all curves again shows that the signal intensity ratios of peptide versus phosphorylated cognate did not significantly change, irrespective of the complexity of the digest, i.e. irrespective of the number of unmodified peptides co-eluting with the species of interest. This is exemplified in Fig. 3, A–D, which display mass spectra at the peak elution of one of the synthetic test peptides (marked with an arrowhead) spiked into various tryptic digests; differences in the sample complexity at the time of elution are obvious. The findings in either of the two sets of experiments do not support the notion that selective suppression of phosphopeptides occurs when analyzed by electrospray ionization mass spectrometry in the presence of unmodified peptides.Fig. 3Mass spectra at the peak elution of the synthetic test peptides spiked into various digests. A synthetic peptide (m/z 800.9, marked with an arrowhead) was spiked at equimolar levels into a tryptic BSA digest (A), ovalbumin digest (B), β-casein digest (C), and digest of an equimolar mixture of ubiquitin, avidin, α-casein, β-casein, carbonic anhydrase, alcohol dehydrogenase, and ovalbumin (D). Rel., relative.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) As control experiment, the absolute signal intensities of the peptides were investigated, and it was found that they were hardly affected by the presence of a large excess of unphosphorylated peptides over the concentration range tested. This is shown in Fig. 2C where the total ion currents (TIC) and the XIC for one exemplary peptide/phosphopeptide (m/z 683.35 versus m/z 710.0) pair in the presence of low amounts of BSA digest (unbroken traces) and in the presence of 100-fold excess of BSA digest (dotted traces) are displayed. The dotted traces are slightly shifted in the time dimension for better clarity. For both species, no obvious loss in signal intensity was observed, i.e. none of the experiments described above supports the general notion of selective ionization suppression of phosphopeptides in the presence of unmodified peptides when analyzing the sample by LC/MS. It should be noted that only samples of fairly low complexity and limited dynamic range were analyzed, and the level of saturated ionization was not reached. To test the issue of selective ionization suppression of phosphopeptides under saturated ionization conditions, i.e. the total number of charges is limited and the analytes are competing for the available charges/protons, several peptide/phosphopeptide pairs were spiked into a 1000-fold excess of tryptic BSA digest (data not shown). As expected the total signal intensity of the peptides and the phosphopeptides were significantly reduced. However, no selective suppression of the phosphorylated species as compared with the unphosphorylated cognate was observed, i.e. the results of this experiment do not support the notion of selected suppression of phosphorylated species even under saturated ionization conditions. It should be noted, however, that the phosphopeptides are affected by the unspecific suppression observed for all unmodified and/or modified peptides of low/substoichiometric abundance under the conditions of saturated ionization. Therefore, analyzing phosphopeptides in very complex peptide mixtures such as unfractionated whole cell lysates will not be very successful because there is such a large excess (in number and relative amount) of unmodified peptides that it is unlikely that a phosphopeptide will be among the most abundant (by amount and/or signal intensity) species, i.e. those species that are detected under saturated ionization conditions. This means that the most successful strategies for the analysis of phosphopeptides from complex protein/peptide mixtures will employ selective enrichment of the phosphopeptides. “Phosphopeptides have lower ionization/detection efficiencies than their unphosphorylated counterpart” is one of the most commonly used arguments for not observing phosphopeptides in a particular sample, i.e. protein digests. This notion is based on the idea that the phosphate group of phosphorylated species is negatively charged, thereby affecting the ionization and detection efficiencies under acidic conditions used for mass spectrometric experiments in positive ion mode. To address this question, whether phosphopeptides indeed have lower detection/ionization efficiencies than their unphosphorylated cognates, the synthetic peptides and phosphopeptides used for the experiments described above were extensively purified by HPLC to homogeneity prior to amino acid analysis in replicate for quantitation. Stock solutions of all peptides were prepared using freshly calibrated pipettes to minimize the chances of pipetting errors, which would give rise to systematic deviations. Each peptide/phosphopeptide pair was mixed in at least two different defined ratios before performing repeated electrospray ionization mass spectrometric analyses. Microscale capillary HPLC was used to introduce the samples into the mass spectrometer. Magic C18 was used for the LC experiments because this reversed-phase material is a commonly used stationary phase in the field of proteomics. The buffers used were the same as described above. To determine the relative ionization/detection efficiencies for the peptide/phosphopeptide pairs, selected ion chromatograms were generated for each observed charge state of every peptide/phosphopeptide pair. Subsequently, the areas under the curves were calculated using the quantitation feature in Analyst QS. These integral values were then corrected for the defined concentration ratios (ranging from 4:1 to 1:4). The corrected ratios of those integrals reflect the ionization/detection efficiency ratio for the different peptide/phosphopeptide pairs. Throughout the article, the ionization/detection efficiency ratio for each peptide versus phosphopeptide is calculated such that a number >1 indicates that the unphosphorylated peptide has a better ionization/detection efficiency, whereas a ratio <1 indicates a better ionization/detection efficiencies for the phosphorylated form. A quadrupole TOF mass spectrometer was used for the experiments. This type of mass spectrometer has a limited dynamic range. However, potential saturation-related problems are compensated for by the isotopic resolution provided by the instrument, which allowed choosing for the calculation of the ionization/detection efficiency ratios the signals of isotopes unaffected by saturation. The results of this set of experiments are listed in Table I, column 4. The peptides are grouped accounting for the number of basic amino acid residues and number of phosphorylation sites. The outcome of the experiments can be summarized as follows: More phosphopeptides species show better ionization/detection efficiencies than their unphosphorylated cognates as compared with the reversed situation. This trend is more pronounced when the peptide contains more than one basic amino acid residue. Even the phosphopeptides with only one basic amino acid residue which resemble as such His-free tryptic peptides show relative ionization/detection efficiencies (peptide versus phosphopeptide) ranging from 0.3 to 1.7 Table I, Peptide species 1–5). About 70% of the peptide pairs show relative ionization/detection efficiencies in the range of 0.5–2. However, it is not obvious (apart from the exceptions mentioned below) which peptide sequences give rise to ionization/detection efficiency differences >2 upon phosphorylation. This reflects the lack of general understanding of what determines the absolute ionization/detection efficiencies of peptides. The ionization/detection efficiency ratio unphosphorylated peptide versus phosphopeptide increases with increasing the charge state. The extent of increase, however, varies significantly. The observed increases varied from 11% (SRARIG(pS)DPLAYEPK: 2+ → 3+ Table I, Peptide species 21 and 22)) to about 800% (KTQA(pS)QGTLQTR: 2+ → 3+ Table I, Peptide species 8 and 9)). One example is presented in Fig. 4, which shows charge states of 2+ to 4+ of the peptide GLGTRTG(pS)NLDRDKL Table I, Peptide species 14–16; please note that the peptide/phosphopeptide were combined in a 2:1 mixture). A clear decrease of the phosphopeptide ion signal relative to the unphosphorylated form is apparent with increasing charge state. Although the number of doubly phosphorylated peptides investigated is too small to draw any general conclusions about their ionization/detection efficiencies as compared with their unphosphorylated cognates, it is still interesting to note that all three test peptides show relative ionization/detection efficiencies similar to those of the singly phosphorylated species. Even in the one case where the number of phosphorylation sites is larger than the number of basic amino acid residues (e.g. DQAV(pT)E(pY)VATR Table I, Peptide species 27)), the ionization/detection efficiency ratio of peptide versus phosphopeptides is only 2.0. It was observed that for the three highly basic peptides, the most highly charged species of the unmodified cognate had ionization/detection efficiencies 2 to 3 orders of magnitude better than the phosphorylated complement (peptide species 16, 20, and 23). One example is given in Fig. 4. The triply charged phosphopeptide GLGTRTGpSNLDRDKL Table I, Peptide species 16) is more efficiently ionized and detected than the unmodified cognate GLGTRTGSNLDRDKL. However, the quadruply charged unmodified species shows a vastly better ionization/detection efficiency as compared with its phosphorylated form, which is almost completely absent. A significant fraction of the molecules of these “exceptional” species show this very high charge state because of the overall proton affinity of the peptides. As soon as the proton affinity is reduced by e.g. phosphorylation, harboring four protons becomes energetically unfavorable, and the ion signal intensity of this charge state becomes negligible. The rather large standard deviations in these exceptional cases result from the limited dynamic range of the instrument used for the study. The findings in this part of the study clearly show a general statement, stating that phosphopeptides show lower ionization/detection efficiencies than their unphosphorylated cognates, does not apply to electrospray ionization mass spectrometry as the majority of the phosphopeptides tested actually show better ionization/detection efficiencies than their unphosphorylated cognates. Similar ionization/detection efficiencies were also found for tryptic-like peptides, i.e. those with only one basic amino acid residue. This finding is supported by other studies from our own and other groups, which determined similar ionization/detection efficiencies for truly tryptic peptide/phosphopeptide pairs, i.e. peptides that were generated by tryptic digestion of proteins (4Steen H. Jebanathirajah J.A. Springer M. Kirschner M.W. Stable isotope-free relative and absolute quantitation of protein phosphorylation stoichiometry by MS.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 3948-3953Google Scholar, 5Tsay Y.G. Wang Y.H. Chiu C.M. Shen B.J. Lee S.C. A strategy for identification and quantitation of phosphopeptides by liquid chromatography/tandem mass spectrometry.Anal. Biochem. 2000; 287: 55-64Google Scholar, 6Hegeman A.D. Harms A.C. Sussman M.R. Bunner A.E. Harper J.F. An isotope labeling strategy for quantifying the degree of phosphorylation at multiple sites in proteins.J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004; 15: 647-653Google Scholar); all these studies report similar ionization/detection efficiencies for tryptic peptides and their unphosphorylated cognates. This raises the questions (or highlights the lack of knowledge about) what determines the ionization/detection efficiencies of peptides. Some preliminary studies have been published investigating the effect of different physicochemical properties of peptides on the ionization/detection efficiencies during electrospray ionization. These studies highlighted a positive correlation between the hydrophobicities and the ionization/detection efficiencies of peptides as well as between pI values and ionization/detection efficiencies (e.g. Refs. 7Cech N.B. Krone J.R. Enke C.G. Predicting electrospray response from chromatographic retention time.Anal. Chem. 2001; 73: 208-213Google Scholar, 8Nielsen M.L. Savitski M.M. Kjeldsen F. Zubarev R.A. Physicochemical properties determining the detectionprobability of tryptic peptides in Fourier transform mass spectrometry. A correlation study.Anal. Chem. 2004; 76: 5872-5877Google Scholar, 9Pan P. Gunawardena H.P. Xia Y. McLuckey S.A. Nanoelectrospray ionization of protein mixtures: solution pH and protein pI.Anal. Chem. 2004; 76: 1165-1174Google Scholar). However, when following their line of argument that the phosphorylated form of a particular peptide should have lower ionization/detection efficiencies than their unmodified cognate because both the hydrophobicity and pI are thought to decrease with the covalent attachment of a phosphate group. Although the pI of a peptide is certainly reduced upon phosphorylation, the effect of phosphorylation on the hydrophobicity is not as clear. As described above, some kind of charge compensation/internal salt bridges/zwitterion formation might actually decrease the hydrophilicity of basic amino acid-containing peptides in diluted formic acid/acetonitrile/water solutions upon phosphorylation. However, a more detailed understanding of the determinants of the ionization/detection efficiencies of peptides still has to be established. Such a study must include the composition of the peptides as well as instrumental parameters and the composition of the spray solution. The importance of the latter was underscored by a phosphorylation analysis on the yeast transcription factor Pho4 performed in our laboratory. The same sample was analyzed twice. The following parameters were varied in the two LC/MS experiments: (i) a different electrospray emitter was used, and (ii) the LC buffer system was changed from water/acetonitrile/0.4% acetic acid/0.005% heptafluorobutyric acid to water/acetonitrile/0.2% formic acid. When observing the signal intensities of the ions corresponding to the phosphopeptide TSSSAEGVVVASE(pS)PVIAPHGSTHAR and its unmodified cognate it was noted that the triply charged species show almost identical intensity ratios for both sets of experimental conditions, whereas the signal intensity ratio of the quadruply charged peptide/phosphopeptide is significantly different, changing from 1.2 to 0.33 (Fig. 5). It should be noted that measuring relative ionization/detection efficiencies of peptides and their phosphorylated cognates is not only of educational importance in the context of this study but can be used for stable-isotope-free quantitation of protein phosphorylation stoichiometries as we have recently shown (4Steen H. Jebanathirajah J.A. Springer M. Kirschner M.W. Stable isotope-free relative and absolute quantitation of protein phosphorylation stoichiometry by MS.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102: 3948-3953Google Scholar). Once such an ionization/detection efficiency ratio has been determined the degree of phosphorylation can easily be calculated based on the ion signal intensity ratio corrected by the relative ionization/detection efficiencies. Because there is a lack of information regarding the factors influencing ionization/detection efficiencies, the ratios have to be determined empirically. However, it is foreseeable that this property can be theoretically estimated in the future once a better understanding of ionization/detection efficiencies has been provided. This would greatly simplify the task of quantitation of protein phosphorylation stoichiometries. The data presented in this study shed some light onto some of the often used reasons explaining why mass spectrometric phosphorylation analysis is so difficult. The reasons investigated included the issue of increased hydrophilicity because of phosphorylation, the concern of selective suppression of phosphopeptides in the presence of unphosphorylated peptides, and the anecdotal lower ionization/detection efficiencies of phosphopeptides as compared with their unphosphorylated cognates. A set of synthetic peptide/phosphopeptide pairs was purified to homogeneity and quantitated by amino acid analysis. These peptide/phosphopeptide pairs were then used for numerous mass spectrometric experiments, which allowed one to address these issues separately. Several conclusions could be drawn from the results of these experiments.

Protein S-acylation (palmitoylation), a reversible post-translational modification, is critically involved in regulating protein subcellular localization, activity, stability, and multimeric complex assembly. However, proteome scale characterization of S-acylation has lagged far behind that of phosphorylation, and global analysis of the localization of S-acylated proteins within different membrane domains has not been reported. Here we describe a novel proteomics approach, designated palmitoyl protein identification and site characterization (PalmPISC), for proteome scale enrichment and characterization of S-acylated proteins extracted from lipid raft-enriched and non-raft membranes. In combination with label-free spectral counting quantitation, PalmPISC led to the identification of 67 known and 331 novel candidate S-acylated proteins as well as the localization of 25 known and 143 novel candidate S-acylation sites. Palmitoyl acyltransferases DHHC5, DHHC6, and DHHC8 appear to be S-acylated on three cysteine residues within a novel CCX7–13C(S/T) motif downstream of a conserved Asp-His-His-Cys cysteine-rich domain, which may be a potential mechanism for regulating acyltransferase specificity and/or activity. S-Acylation may tether cytoplasmic acyl-protein thioesterase-1 to membranes, thus facilitating its interaction with and deacylation of membrane-associated S-acylated proteins. Our findings also suggest that certain ribosomal proteins may be targeted to lipid rafts via S-acylation, possibly to facilitate regulation of ribosomal protein activity and/or dynamic synthesis of lipid raft proteins in situ. In addition, bioinformatics analysis suggested that S-acylated proteins are highly enriched within core complexes of caveolae and tetraspanin-enriched microdomains, both cholesterol-rich membrane structures. The PalmPISC approach and the large scale human S-acylated protein data set are expected to provide powerful tools to facilitate our understanding of the functions and mechanisms of protein S-acylation. Protein S-acylation (palmitoylation), a reversible post-translational modification, is critically involved in regulating protein subcellular localization, activity, stability, and multimeric complex assembly. However, proteome scale characterization of S-acylation has lagged far behind that of phosphorylation, and global analysis of the localization of S-acylated proteins within different membrane domains has not been reported. Here we describe a novel proteomics approach, designated palmitoyl protein identification and site characterization (PalmPISC), for proteome scale enrichment and characterization of S-acylated proteins extracted from lipid raft-enriched and non-raft membranes. In combination with label-free spectral counting quantitation, PalmPISC led to the identification of 67 known and 331 novel candidate S-acylated proteins as well as the localization of 25 known and 143 novel candidate S-acylation sites. Palmitoyl acyltransferases DHHC5, DHHC6, and DHHC8 appear to be S-acylated on three cysteine residues within a novel CCX7–13C(S/T) motif downstream of a conserved Asp-His-His-Cys cysteine-rich domain, which may be a potential mechanism for regulating acyltransferase specificity and/or activity. S-Acylation may tether cytoplasmic acyl-protein thioesterase-1 to membranes, thus facilitating its interaction with and deacylation of membrane-associated S-acylated proteins. Our findings also suggest that certain ribosomal proteins may be targeted to lipid rafts via S-acylation, possibly to facilitate regulation of ribosomal protein activity and/or dynamic synthesis of lipid raft proteins in situ. In addition, bioinformatics analysis suggested that S-acylated proteins are highly enriched within core complexes of caveolae and tetraspanin-enriched microdomains, both cholesterol-rich membrane structures. The PalmPISC approach and the large scale human S-acylated protein data set are expected to provide powerful tools to facilitate our understanding of the functions and mechanisms of protein S-acylation. Protein S-acylation, commonly but somewhat inaccurately known as protein palmitoylation, is a post-translational lipid modification involving the covalent addition of long-chain fatty acids (predominantly the 16-carbon palmitic acid) to protein cysteine thiols via thioester linkages (1Linder M.E. Deschenes R.J. Palmitoylation: policing protein stability and traffic.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8: 74-84Crossref PubMed Scopus (773) Google Scholar). Like other lipid modifications such as myristoylation and prenylation, S-acylation increases the hydrophobicity of cytoplasmic proteins, including many signaling molecules, thereby increasing their affinity for cytosolic membrane surfaces. However, compared with myristoylation and prenylation, S-acylation is more frequently detected on transmembrane proteins such as G protein-coupled receptors, immune cell receptors, and ion channels, all of which are already tightly associated with membranes (2Resh M.D. Palmitoylation of ligands, receptors, and intracellular signaling molecules.Sci. STKE. 2006; 2006: re14Crossref PubMed Scopus (341) Google Scholar). Moreover, protein S-acylation, which may either occur spontaneously or be catalyzed by palmitoyl acyltransferases (PATs), 1The abbreviations used are:PATpalmitoyl acyltransferaseABEacyl-biotinyl exchangeAPT1acyl-protein thioesterase-1biotin-HPDPN-[6-(biotinamido)hexyl]-3′-(2′-pyridyldithio)propionamideCav-1caveolin-1CMchloroform/methanolCONcontrolCRDcysteine-rich domainCTxBcholera toxin B subunitDHHCAsp-His-His-CysDRMdetergent-resistant membraneEXPexperimentalHAhydroxylamineIPAIngenuity Pathway AnalysisNEMN-ethylmaleimidePalmPISCpalmitoyl protein identification and site characterizationRPribosomal proteinRTroom temperature17-ODYA17-octadecynoic acidTCEPtris(2-carboxyethyl)phosphine2-BP2-bromopalmitateLTQlinear trap quadrupolepAbpolyclonal antibodymAbmonoclonal antibodyIPIInternational Protein IndexGM1Galβ1–3GalNAcβ1–4Gal(3–2αNeuAc)β1–4Glcβ1–1Cer can be reversed by protein thioesterases such as acyl-protein thioesterase-1 (APT1) and protein palmitoylthioesterase-1 (1Linder M.E. Deschenes R.J. Palmitoylation: policing protein stability and traffic.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8: 74-84Crossref PubMed Scopus (773) Google Scholar, 2Resh M.D. Palmitoylation of ligands, receptors, and intracellular signaling molecules.Sci. STKE. 2006; 2006: re14Crossref PubMed Scopus (341) Google Scholar). In this respect, protein S-acylation, as a dynamic and reversible modification, can be regarded as potentially analogous to protein phosphorylation. Notably, reversibility is not shared by any other lipid modification, making S-acylation an attractive mechanism for modulation of protein activity and stability, protein-protein interactions, and shuttling of proteins between subcellular compartments in response to changes in signal transduction (1Linder M.E. Deschenes R.J. Palmitoylation: policing protein stability and traffic.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8: 74-84Crossref PubMed Scopus (773) Google Scholar, 3Greaves J. Chamberlain L.H. Palmitoylation-dependent protein sorting.J. Cell Biol. 2007; 176: 249-254Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar). palmitoyl acyltransferase acyl-biotinyl exchange acyl-protein thioesterase-1 N-[6-(biotinamido)hexyl]-3′-(2′-pyridyldithio)propionamide caveolin-1 chloroform/methanol control cysteine-rich domain cholera toxin B subunit Asp-His-His-Cys detergent-resistant membrane experimental hydroxylamine Ingenuity Pathway Analysis N-ethylmaleimide palmitoyl protein identification and site characterization ribosomal protein room temperature 17-octadecynoic acid tris(2-carboxyethyl)phosphine 2-bromopalmitate linear trap quadrupole polyclonal antibody monoclonal antibody International Protein Index Galβ1–3GalNAcβ1–4Gal(3–2αNeuAc)β1–4Glcβ1–1Cer Evidence suggests that protein S-acylation may play important roles in a wide range of biological processes such as cell signaling, apoptosis, and carcinogenesis (4Tsutsumi R. Fukata Y. Fukata M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes.Pfluegers Arch. Eur. J. Physiol. 2008; 456: 1199-2206Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar, 5Baekkeskov S. Kanaani J. Palmitoylation cycles and regulation of protein function.Mol. Membr. Biol. 2009; 26: 42-54Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar). However, understanding of the mechanisms and functions of reversible S-acylation has progressed at a slow pace because of several challenges. First, S-acylated proteins are generally present in low abundance. Second, long-chain fatty acids attached to proteins via thioester bonds turn over rapidly. Third, although a class of PATs sharing a conserved Asp-His-His-Cys (DHHC) motif within a cysteine-rich domain (CRD), as well as several deacylating enzymes, has been recognized for several years, the enzymology of protein S-acylation and deacylation remains poorly understood (6Zeidman R. Jackson C.S. Magee A.I. Protein acyl thioesterases.Mol. Membr. Biol. 2009; 26: 32-41Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar). Fourth, there is no general consensus motif for S-acylation site prediction. Although two software tools, CSS-PALM (7Ren J. Wen L. Gao X. Jin C. Xue Y. Yao X. CSS-Palm 2.0: an updated software for palmitoylation sites prediction.Protein Eng. Des. Sel. 2008; 21: 639-644Crossref PubMed Scopus (423) Google Scholar) and NBA-PALM (8Xue Y. Chen H. Jin C. Sun Z. Yao X. NBA-Palm: prediction of palmitoylation site implemented in naive Bayes algorithm.BMC Bioinformatics. 2006; 7: 458Crossref PubMed Scopus (75) Google Scholar), have recently been developed to predict S-acylation sites on proteins, their reliability is uncertain. Last and important, no convenient method (e.g. S-acylation-specific antibody) is available to detect and purify S-acylated proteins. The commonly used [3H]palmitate in vivo labeling method is hazardous, sometimes insufficiently sensitive, and time-consuming, typically requiring several weeks or months for autoradiographic exposure (9Roth A.F. Wan J. Green W.N. Yates J.R. Davis N.G. Proteomic identification of palmitoylated proteins.Methods. 2006; 40: 135-142Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar). To gain a more comprehensive view of protein S-acylation in vivo, two independent and complementary methods have been developed to detect and/or purify S-acylated proteins at the proteome scale. One method involves the metabolic incorporation of an azide- or alkyne-containing palmitate analogue into proteins (10Hang H.C. Geutjes E.J. Grotenbreg G. Pollington A.M. Bijlmakers M.J. Ploegh H.L. Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells.J. Am. Chem. Soc. 2007; 129: 2744-2745Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar, 11Kostiuk M.A. Corvi M.M. Keller B.O. Plummer G. Prescher J.A. Hangauer M.J. Bertozzi C.R. Rajaiah G. Falck J.R. Berthiaume L.G. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.FASEB J. 2008; 22: 721-732Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar, 12Martin B.R. Cravatt B.F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.Nat. Methods. 2009; 6: 135-138Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar). The azido/alkynyl groups, which are metabolically inert in cellular environments, can be specifically and efficiently conjugated with a tag (e.g. biotin, Myc, and fluorescein) by chemoselective ligations (e.g. Staudinger reaction or azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition reaction) in vitro. Consequently, fatty acylated proteins containing the azide/alkyne moiety can be detected and/or purified with minimal contamination. Using this method, Martin and Cravatt (12Martin B.R. Cravatt B.F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.Nat. Methods. 2009; 6: 135-138Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar) have recently purified 17-octadecynoic acid (17-ODYA)-modified proteins from immortalized Jurkat T cells. Multidimensional protein identification technology analysis and spectral counting quantification led to the identification of 125 high confidence and about 200 medium confidence predicted palmitoylated proteins (12Martin B.R. Cravatt B.F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.Nat. Methods. 2009; 6: 135-138Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar). However, the metabolic labeling method cannot be readily applied to analyze tissue samples. It is also potentially difficult to use this method to study protein S-acylation in cancer cells, in which overexpression and hyperactivity of fatty-acid synthase dramatically decrease the intake of exogenous long-chain fatty acids (13Menendez J.A. Colomer R. Lupu R. Why does tumor-associated fatty acid synthase (oncogenic antigen-519) ignore dietary fatty acids.Med. Hypotheses. 2005; 64: 342-349Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar). A second method, named acyl-biotinyl exchange (ABE) (14Drisdel R.C. Green W.N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.BioTechniques. 2004; 36: 276-285Crossref PubMed Google Scholar, 15Roth A.F. Wan J. Bailey A.O. Sun B. Kuchar J.A. Green W.N. Phinney B.S. Yates 3rd, J.R. Davis N.G. Global analysis of protein palmitoylation in yeast.Cell. 2006; 125: 1003-1013Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (431) Google Scholar, 16Kang R. Wan J. Arstikaitis P. Takahashi H. Huang K. Bailey A.O. Thompson J.X. Roth A.F. Drisdel R.C. Mastro R. Green W.N. Yates 3rd, J.R. Davis N.G. El-Husseini A. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.Nature. 2008; 456: 904-909Crossref PubMed Scopus (429) Google Scholar), has been more widely used than the palmitate analogue labeling method. In this approach, thioester bonds are selectively cleaved by neutral hydroxylamine (HA), and S-acyl moieties are replaced by biotinyl groups. Consequently, S-acylated proteins can be detected and/or purified via streptavidin-biotin interactions. Given that no metabolic labeling is required, the ABE approach can be readily applied to analyze tissue samples and cancer cells. In the first ever global analysis of protein S-acylation, Roth et al. (15Roth A.F. Wan J. Bailey A.O. Sun B. Kuchar J.A. Green W.N. Phinney B.S. Yates 3rd, J.R. Davis N.G. Global analysis of protein palmitoylation in yeast.Cell. 2006; 125: 1003-1013Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (431) Google Scholar) enriched S-acylated proteins from yeast and validated the S-acylation of 35 proteins from 58 novel candidate S-acylated proteins. More recently, Kang et al. (16Kang R. Wan J. Arstikaitis P. Takahashi H. Huang K. Bailey A.O. Thompson J.X. Roth A.F. Drisdel R.C. Mastro R. Green W.N. Yates 3rd, J.R. Davis N.G. El-Husseini A. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.Nature. 2008; 456: 904-909Crossref PubMed Scopus (429) Google Scholar) identified 68 known and >200 candidate S-acylated proteins from whole rat brain, purified rat synaptosomes, and cultured embryonic rat neurons. Among these S-acylated protein candidates, 21 were confirmed by [3H]palmitate labeling, immunoprecipitation/ABE, and/or ABE/immunoblotting (16Kang R. Wan J. Arstikaitis P. Takahashi H. Huang K. Bailey A.O. Thompson J.X. Roth A.F. Drisdel R.C. Mastro R. Green W.N. Yates 3rd, J.R. Davis N.G. El-Husseini A. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.Nature. 2008; 456: 904-909Crossref PubMed Scopus (429) Google Scholar). Although both proteomics methods have been demonstrated to be powerful for global analysis of protein S-acylation, the procedures reported in the above studies are not suitable for S-acylation site localization. Recently, Zhang et al. (17Zhang J. Planey S.L. Ceballos C. Stevens Jr., S.M. Keay S.K. Zacharias D.A. Identification of CKAP4/p63 as a major substrate of the palmitoyl acyltransferase DHHC2, a putative tumor suppressor, using a novel proteomics method.Mol. Cell. Proteomics. 2008; 7: 1378-1388Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (86) Google Scholar) applied their adaptation of the ABE method, called palmitoyl-cysteine isolation capture and analysis, to screen substrates of human DHHC2 in HeLa cells. A total of 57 sites were identified from 50 proteins, but the majority of the identified proteins are abundant cytoplasmic proteins, and half of the sites were identified only once in four runs, indicating that this method is technically limited. In addition, no controls were used to distinguish putative S-acylated peptides from contaminating peptides; thus, the actual S-acylation sites were not evaluated. All the above mentioned large scale studies were performed on total membranes. However, biological membranes are not homogeneous but instead are compartmentalized into microdomains that exhibit particular lipid and protein compositions. Lipid rafts, a designation that includes vesicular caveolae, are liquid-ordered membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids (18Jacobson K. Mouritsen O.G. Anderson R.G. Lipid rafts: at a crossroad between cell biology and physics.Nat. Cell Biol. 2007; 9: 7-14Crossref PubMed Scopus (910) Google Scholar, 19Freeman M.R. Solomon K.R. Cholesterol and prostate cancer.J. Cell. Biochem. 2004; 91: 54-69Crossref PubMed Scopus (223) Google Scholar). Because of the saturated nature of palmitate, protein S-palmitoylation (the highly predominant form of S-acylation) has been proposed to target proteins to lipid rafts, a claim supported by studies of a limited number of proteins (20Brown D.A. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals.Physiology. 2006; 21: 430-439Crossref PubMed Scopus (393) Google Scholar). However, no proteome scale localization of palmitoylated/S-acylated proteins in different membrane domains has been reported to date. In the present study, we isolated lipid raft-enriched and non-raft membrane fractions using a recently described procedure shown to be suitable for proteomics studies (21Adam R.M. Yang W. DiVizio D. Mukhopadhyay N.K. Steen H. Rapid preparation of nuclei-depleted detergent-resistant membrane fractions suitable for proteomics analysis.BMC Cell Biol. 2008; 9: 30Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar). With this approach, S-acylated proteins and peptides were purified and then analyzed using a novel ABE-based method designated palmitoyl protein identification and site characterization (PalmPISC). In combination with the widely used label-free spectral counting method of quantitation (22Liu H. Sadygov R.G. Yates 3rd, J.R. A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.Anal. Chem. 2004; 76: 4193-4201Crossref PubMed Scopus (2076) Google Scholar), PalmPISC led to the identification of 67 known and 331 novel candidate S-acylated proteins as well as the localization of 25 known and 143 novel candidate S-acylation sites. The PalmPISC approach, in combination with other tools such as stable isotope labeling with amino acids in cell culture, RNA interference, and cell imaging techniques, will greatly expand our understanding of protein S-acylation as a regulatory post-translational modification. The human prostate cancer cell line DU145 was obtained from the American Type Culture Collection. DU145 cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (Valley Biomedical) supplemented with 2 mm l-glutamine (Invitrogen), 100 units/ml penicillin (Invitrogen), and 100 µg/ml streptomycin (Invitrogen) in a water-saturated 5% CO2 atmosphere at 37 °C. Cells were dissociated with 0.05% trypsin plus 0.02% EDTA (Invitrogen) and subcultured with 1:7 split ratios every 3–4 days. DU145 cells were harvested when they reached 90% confluence. Cells were rinsed three times with cold PBS (Invitrogen), scraped off 150-mm culture dishes (Falcon), and pelleted at 500 × g for 5 min. Lipid raft-enriched and non-raft membrane fractions were isolated using a modified successive detergent extraction method as described previously (21Adam R.M. Yang W. DiVizio D. Mukhopadhyay N.K. Steen H. Rapid preparation of nuclei-depleted detergent-resistant membrane fractions suitable for proteomics analysis.BMC Cell Biol. 2008; 9: 30Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar). Briefly, DU145 cells were homogenized and centrifuged at 500 × g for 5 min to pellet nuclei and intact cells. The resulting supernatant was centrifuged at 16,000 × g for 20 min to pellet membranes. Non-raft fractions were extracted with 1% Triton X-100, and lipid raft-enriched fractions were subsequently isolated with 60 mm β-octyl glucoside. Immunoblotting analysis was performed to confirm the enrichment of lipid raft markers caveolin-1 (Cav-1) and Giα2 as well as the cytosol/non-raft marker β-tubulin in lipid raft-enriched fractions and non-raft fractions, respectively. ABE was performed as described previously (15Roth A.F. Wan J. Bailey A.O. Sun B. Kuchar J.A. Green W.N. Phinney B.S. Yates 3rd, J.R. Davis N.G. Global analysis of protein palmitoylation in yeast.Cell. 2006; 125: 1003-1013Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (431) Google Scholar, 23Wan J. Roth A.F. Bailey A.O. Davis N.G. Palmitoylated proteins: purification and identification.Nat. Protoc. 2007; 2: 1573-1584Crossref PubMed Scopus (309) Google Scholar) with some modifications. Protein extracts from lipid raft-enriched and non-raft membrane fractions were precipitated using the chloroform/methanol (CM) precipitation method. Protein pellets were redissolved with 4% SDS Buffer (50 mm Tris-HCl, 4% SDS, 5 mm EDTA, pH7.4) at 37 °C for 10 min. Protein concentration was determined using the Micro BCA protein assay (Pierce) according to the manufacturer's instructions. Following dilution with 3 volumes of Dilution Buffer (50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 0.2% Triton X-100, 1 mm PMSF, protease inhibitor mixture, pH 7.4), samples were reduced with 10 mm tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) (Pierce) for 30 min and alkylated with 50 mm N-ethylmaleimide (NEM) (Fluka) for 2.5 h at room temperature (RT) with end-over-end rotation. Excess NEM was removed with five sequential CM precipitations. Protein pellets were redissolved with 4% SDS Buffer and divided equally into two portions. To each portion was added 3 volumes of freshly prepared 1.33 mm N-[6-(biotinamido)hexyl]-3′-(2′-pyridyldithio)propionamide (biotin-HPDP) (Pierce), 0.27% Triton X-100, 33.3% N,N-dimethylformamide, 1.33 mm PMSF, protease inhibitor mixture, pH 7.4 containing 1 m HA (experimental (EXP) group) or 50 mm Tris-HCl (control (CON) group). Samples were incubated at RT for 60 min with end-over-end rotation, and excess biotin-HPDP was removed by three sequential CM precipitations. Protein pellets were redissolved with 2% SDS Buffer (50 mm Tris-HCl, 2% SDS, 5 mm EDTA, pH 7.4) at 37 °C for 10 min, and then 19 volumes of Dilution Buffer was added to decrease the concentration of SDS to 0.1%. Following incubation at RT for 30 min with end-over-end rotation, EXP and CON samples were centrifuged at 16,000 × g for 5 min. The supernatants were incubated with streptavidin-agarose beads (GE Healthcare) pre-equilibrated with 50 volumes of Equilibration Buffer (50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 0.2% Triton X-100, 0.1% SDS, pH 7.4). After 1-h incubation at RT with end-over-end rotation, streptavidin-agarose beads were washed with 50 volumes of Equilibration Buffer six times. Bound proteins were eluted by incubating beads with 10 volumes of 20 mm TCEP in Equilibration Buffer for 30 min at RT with end-over-end rotation. Samples were centrifuged at 200 × g for 1 min to pellet beads. The supernatants were moved to new Eppendorf tubes and centrifuged again. Enriched proteins were recovered by a CM precipitation, resolved by 12.5% SDS-PAGE, and stained with Coomassie Brilliant Blue solution (Bio-Rad). In-gel digestion was performed essentially as described (24Yang W. Liu P. Liu Y. Wang Q. Tong Y. Ji J. Proteomic analysis of rat pheochromocytoma PC12 cells.Proteomics. 2006; 6: 2982-2990Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar, 25Di Vizio D. Kim J. Hager M.H. Morello M. Yang W. Lafargue C.J. True L.D. Rubin M.A. Adam R.M. Beroukhim R. Demichelis F. Freeman M.R. Oncosome formation in prostate cancer: association with a region of frequent chromosomal deletion in metastatic disease.Cancer Res. 2009; 69: 5601-5609Crossref PubMed Scopus (285) Google Scholar). Each lane was cut into four gel slices, reduced with 10 mm DTT in 50 mm NH4HCO3 for 45 min, and alkylated with 55 mm iodoacetamide in 50 mm NH4HCO3 for 45 min in the dark. Proteins were in-gel digested with MS grade trypsin (Promega) and incubated at 58 °C for 30 min. Tryptic peptides were successively extracted with 100 µl of 5% acetic acid, 100 µl of 2.5% acetic acid and 50% acetonitrile, and 100 µl of 100% acetonitrile. Samples were dried down in vacuo using a SpeedVac concentrator (Thermo Scientific) and stored at −80 °C until mass spectrometric analysis. Protein pellets obtained after ABE chemistry were redissolved with 2% SDS Buffer, diluted with 19 volumes of Dilution Buffer, and digested in solution with trypsin by incubating at 58 °C for 60 min. After centrifugation at 16,000 × g for 5 min, supernatants were combined with pre-equilibrated streptavidin-agarose beads and incubated at RT for 60 min with end-over-end rotation. Beads were successively washed with 50 volumes of Equilibrating Buffer five times and 20% acetonitrile in 10 mm NH4HCO3 buffer twice and then incubated with 2.5 volumes of 5 mm TCEP, 10 mm NH4HCO3, 20% acetonitrile solution at 37 °C for 30 min. Samples were centrifuged at 200 × g for 1 min, and the supernatants were centrifuged again. Finally, the supernatants were moved to LoBind tubes (Eppendorf), dried down in a SpeedVac concentrator, and stored at −80 °C until mass spectrometric analysis. Peptides derived from in-gel digested proteins were analyzed by on-line C18 nanoflow reversed-phase HPLC (Eksigent nanoLC·2DTM) connected to an LTQ Orbitrap mass spectrometer (Thermo Scientific). Samples were loaded onto an in-house packed 100-µm-inner diameter × 15-cm C18 column (Magic C18, 5 µm, 200 Å, Michrom Bioresources Inc.) and separated at 200 nl/min with 80-min linear gradients from 5 to 35% acetonitrile in 0.4% formic acid. Survey spectra were acquired in the Orbitrap with the resolution set to a value of 30,000. Up to five of the most intense ions per cycle were fragmented and analyzed in the linear trap. Peptides derived from in-solution digested proteins were analyzed on an LTQ ProteomeX mass spectrometer connected to a Surveyor HPLC pump and a microsampler (all from Thermo Scientific). Peptides were separated at about 400 nl/min with 80-min linear gradients from 5 to 35% acetonitrile in 0.4% formic acid. The ion trap was operated in data-dependent acquisition mode, fragmenting up to six of the most intensive ions after each survey scan. The Thermo .raw files were converted into complete peak lists and entered into a relational database. The data conversion was carried out using in-house written software (26Renard B.Y. Kirchner M. Monigatti F. Ivanov A.R. Rappsilber J. Winter D. Steen J.A. Hamprecht F.A. Steen H. When less can yield more—computational preprocessing of MS/MS spectra for peptide identification.Proteomics. 2009; 9: 4978-4984Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) utilizing the XRawfile2.dll library (version 2.1.1.0), which was provided by Thermo Scientific as part of the Xcalibur software package. The library is also used by MSQuant, Trans-Proteomic Pipeline, and the Sashimi project to convert the proprietary .raw file format into generic peak lists. For each MS/MS spectrum, the 200 most intense fragment ions were converted into an .mgf file without any further data processing such as smoothing, deisotoping, and filtering. Comparisons between the .mgf files generated by our approach and those generated by DTASuperCharge showed that our approach performed favorably (26Renard B.Y. Kirchner M. Monigatti F. Ivanov A.R. Rappsilber J. Winter D. Steen J.A. Hamprecht F.A. Steen H. When less can yield more—computational preprocessing of MS/MS spectra for peptide identification.Proteomics. 2009; 9: 4978-4984Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar). All MS data sets were searched against the IPI_Human database (v3.36; 69,012 sequences) using the MASCOT search engine (Matrix Science, v2.1.04). For Orbitrap data, no fixed modification was set for any of the amino acids; variable protein modifications were selected as carbamidomethyl (Cys), deamidation (Asn and Gln), N-acetyl (protein N terminus), NEM (Cys), and oxidation (Met). The mass tolerance was set as ±20 ppm for MS spectra and ±0.8 Da for MS/MS spectra. Peptides were identified with an ion score no less than 33 (p < 0.05), and finally proteins were identified based on at least two unique peptides. For ion trap data, no fixed modification was set for any of the amino acids; variable protein modifications were selected as N-acetyl (protein N terminus), NEM (Cys), and oxidation (Met). The mass tolerance was set as ±1.5 Da for MS spectra and ±1.5 Da for MS/MS spectra. Peptides were identified with an ion score above 41 (p < 0.05). For both data sets, up to one missed tryptic cleavage was allowed, and probable contaminants (e.g. keratins and albumin) were removed from the identified protein/peptide lists. The relative protein/peptide abundance changes between the paired EXP and CON samples were determined using a label-free spectral counting approach (22Liu H. Sadygov R.G. Yates 3rd, J.R. A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.Anal. Chem. 2004; 76: 4193-4201Crossref PubMed Scopus (2076) Google Scholar). For both data sets generated by the protein-based procedure and by the peptide-based procedure, the spectral counts were merged over all biological/technical repli

Objective We previously identified a circulating autoantibody against a 43 kDa muscle autoantigen in sporadic inclusion body myositis (IBM) and demonstrated the feasibility of an IBM diagnostic blood test. Here, we sought to identify the molecular target of this IBM autoantibody, understand the relationship between IBM autoimmunity and muscle degeneration, and develop an IBM blood test with high diagnostic accuracy. Methods IBM blood samples were screened using mass spectrometry and a synthetic human peptidome. Plasma and serum samples (N=200 patients) underwent immunoblotting assays, and results were correlated to clinical features. Muscle biopsy samples (n=30) were examined by immunohistochemistry and immunoblotting. Exome or whole genome sequencing was performed on DNA from 19 patients. Results Both mass spectrometry and screening of a 413,611 human peptide library spanning the entire human proteome identified cytosolic 5′‐nucleotidase 1A (cN1A; NT5C1A) as the likely 43 kDa IBM autoantigen, which was then confirmed in dot blot and Western blot assays using recombinant cN1A protein. Moderate reactivity of anti‐cN1A autoantibodies was 70% sensitive and 92% specific, and high reactivity was 34% sensitive and 98% specific for the diagnosis of IBM. One to 3 major cN1A immunodominant epitopes were identified. cN1A reactivity by immunohistochemistry accumulated in perinuclear regions and rimmed vacuoles in IBM muscle, localizing to areas of myonuclear degeneration. Interpretation Autoantibodies against cN1A are common in and highly specific to IBM among muscle diseases, and may provide a link between IBM's dual processes of autoimmunity and myodegeneration. Blood diagnostic testing is feasible and should improve early and reliable diagnosis of IBM. Ann Neurol 2013;73:408–418

The Mycobacterium tuberculosis genome encodes 11 serine/threonine protein kinases (STPKs) that are structurally related to eukaryotic kinases. To gain insight into the role of Ser/Thr phosphorylation in this major global pathogen, we used a phosphoproteomic approach to carry out an extensive analysis of protein phosphorylation in M. tuberculosis . We identified more than 500 phosphorylation events in 301 proteins that are involved in a broad range of functions. Bioinformatic analysis of quantitative in vitro kinase assays on peptides containing a subset of these phosphorylation sites revealed a dominant motif shared by six of the M. tuberculosis STPKs. Kinase assays on a second set of peptides incorporating targeted substitutions surrounding the phosphoacceptor validated this motif and identified additional residues preferred by individual kinases. Our data provide insight into processes regulated by STPKs in M. tuberculosis and create a resource for understanding how specific phosphorylation events modulate protein activity. The results further provide the potential to predict likely cognate STPKs for newly identified phosphoproteins.

Lysine-specific demethylase 1 (LSD1) has been reported to repress and activate transcription by mediating histone H3K4me1/2 and H3K9me1/2 demethylation, respectively. The molecular mechanism that underlies this dual substrate specificity has remained unknown. Here we report that an isoform of LSD1, LSD1+8a, does not have the intrinsic capability to demethylate H3K4me2. Instead, LSD1+8a mediates H3K9me2 demethylation in collaboration with supervillin (SVIL), a new LSD1+8a interacting protein. LSD1+8a knockdown increases H3K9me2, but not H3K4me2, levels at its target promoters and compromises neuronal differentiation. Importantly, SVIL co-localizes to LSD1+8a-bound promoters, and its knockdown mimics the impact of LSD1+8a loss, supporting SVIL as a cofactor for LSD1+8a in neuronal cells. These findings provide insight into mechanisms by which LSD1 mediates H3K9me demethylation and highlight alternative splicing as a means by which LSD1 acquires selective substrate specificities (H3K9 versus H3K4) to differentially control specific gene expression programs in neurons.

Abstract Severe coronavirus disease 2019 (COVID-19) is characterized by systemic inflammation and can result in protracted symptoms. Robust systemic inflammation may trigger persistent changes in hematopoietic cells and innate immune memory through epigenetic mechanisms. We reveal that rare circulating hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC), enriched from human blood, match the diversity of HSPC in bone marrow, enabling investigation of hematopoiesis and HSPC epigenomics. Following COVID-19, HSPC retain epigenomic alterations that are conveyed, through differentiation, to progeny innate immune cells. Epigenomic changes vary with disease severity, persist for months to a year, and are associated with increased myeloid cell differentiation and inflammatory or antiviral programs. Epigenetic reprogramming of HSPC may underly altered immune function following infection and be broadly relevant, especially for millions of COVID-19 survivors. One Sentence Summary Transcriptomic and epigenomic analysis of blood reveal sustained changes in hematopoiesis and innate immunity after COVID-19. Graphical Abstract