Abstract Primary resistance drastically limits the clinical success of immune checkpoint blockade (ICB) in melanoma. Resistance to ICB may also develop when tumours relapse after targeted therapy. To identify cancer cell-intrinsic mechanisms driving resistance to ICB, we generated single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data from a prospective longitudinal cohort of patients on ICB therapy, including an early time point obtained after only one cycle of treatment. Comparing these data with murine scRNA-seq datasets, we established a comprehensive view of the cellular architecture of the treatment-naïve melanoma ecosystem, and defined 6 evolutionarily conserved melanoma transcriptional metaprograms (Melanocytic or MEL, Mesenchymal-like or MES, Neural Crest-like, Antigen Presentation, Stress (hypoxia response) and Stress (p53 response)). Spatial multi-omics revealed a non-random geographic distribution of cell states that is, at least partly, driven by the tumour microenvironment. The single-cell data allowed unambiguous discrimination between melanoma MES cells and cancer-associated fibroblasts both in silico and in situ , a long-standing challenge in the field. Importantly, two of the melanoma transcriptional metaprograms were associated with divergent clinical responses to ICB. While the Antigen Presentation cell population was more abundant in tumours from patients who exhibited a clinical response to ICB, MES cells were significantly enriched in early on-treatment biopsies from non-responders, and their presence significantly predicted lack of response. Critically, we identified TCF4 (E2-2) as a master regulator of the MES program and suppressor of both MEL and Antigen Presentation programs. Targeting TCF4 expression in MES cells either genetically or pharmacologically using a bromodomain inhibitor increased immunogenicity and sensitivity to targeted therapy. This study describes an increasingly complex melanoma transcriptional landscape and its rapid evolution under ICB. It also identifies a putative biomarker of early response to ICB and an epigenetic therapeutic strategy that increases both immunogenicity of ICB-refractory melanoma and their sensitivity to targeted therapy.

Summary The ability to predict the future behaviour of an individual cancer is crucial for precision cancer medicine and, in particular, for the development of strategies that prevent acquisition of resistance to anti-cancer drugs. Therapy resistance, which often develops from a heterogeneous pool of drug-tolerant cells known as minimal residual disease (MRD), is thought to mainly occur through acquisition of genetic alterations. Increasing evidence, however, indicates that drug resistance might also be acquired though nongenetic mechanisms. A key emerging question is therefore whether specific molecular and/or cellular features of the MRD ecosystem determine which of these two distinct resistance trajectories will eventually prevail. We show herein that, in melanoma exposed to MAPK-therapeutics, the presence of a neural crest stem cell (NCSC) subpopulation in MRD concurred with the rapid development of resistance through nongenetic mechanisms. Emergence of this drug-tolerant population in MRD relies on a GDNF-dependent autocrine and paracrine signalling cascade, which activates the AKT survival pathway in a Focal-adhesion kinase-(FAK) dependent manner. Ablation of this subpopulation through inhibition of FAK/SRC-signalling delayed relapse in patient-derived tumour xenografts. Strikingly, all tumours that eventually escaped this treatment exhibited resistance-conferring genetic alterations and increased sensitivity to ERK-inhibition. These findings firmly establish that nongenetic reprogramming events contribute to therapy resistance in melanoma and identify a clinically-compatible approach that abrogates such a trajectory. Importantly, these data demonstrate that the cellular composition of MRD deterministically imposes distinct drug resistance evolutionary paths and highlight key principles that may permit more effective pre-emptive therapeutic interventions.

Abstract Responses to anticancer therapies in patients with advanced metastatic disease are often lower than 50% and the majority of patients initially responding develop resistance later on. Therapy resistance often follows an adaptation phase in which cancer cells exit the cell cycle and engage the Integrated Stress Response (ISR). Activation of this pathway induces the emergence of drug-tolerant persister cells via the block of CAP-dependent translation while enhancing translation of select mRNAs that support survival, migration and dampen immunogenicity. Little is known about the molecular mechanisms underlying ISR-dependent immune escape. Searching for transcripts specifically associated with polysomes upon ISR activation we identified the lncRNA LISR . We showed that this untranslated transcript, could suppress the production of putative neoantigens, while promoting translation of PD-L1 and other mRNAs involved in the formation of the glycocalyx. Accordingly, LISR locus is amplified in 60% of melanomas and its expression is increased in patients refractory to Immune Checkpoint Blockade (ICB). Consequently, inhibition of LISR stimulated anti-tumour immune responses both in vitro and in humanized and ICB-resistant patient-derived xenografts. This study establishes a link between lncRNAs, translation rewiring in cancer and immunogenicity, and identifies an RNA-based cancer-specific therapeutic strategy to overcome intrinsic resistance to ICB.

ABSTRACT Tumor endothelial cells (TECs) actively repress inflammatory responses and maintain an immune-excluded tumor phenotype. However, the molecular mechanisms that sustain TEC-mediated immunosuppression remain largely elusive. Here, we show that autophagy ablation in TECs boosts antitumor immunity by supporting infiltration and effector function of T cells, thereby restricting melanoma growth. In melanoma-bearing mice, loss of TEC autophagy leads to the transcriptional expression of an immunostimulatory/inflammatory TEC phenotype driven by heightened NF-kB and STING signaling. In line, single-cell transcriptomic datasets from melanoma patients disclose an enriched Inflammatory High /Autophagy Low TEC phenotype in correlation with clinical responses to immunotherapy. Congruently, patients responding to immunotherapy exhibit an increased presence of inflamed vessels, interfacing with infiltrating CD8+ T cells. Mechanistically, STING-dependent immunity in TECs is not critical for the immunomodulatory effects of autophagy ablation, since NF-kB-driven inflammation remains functional in STING/ATG5 double knockout TECs. Hence, autophagy is a principal tumor vascular anti-inflammatory mechanism dampening melanoma antitumor immunity.

Immune checkpoint blockade (ICB) has become a standard of care in the treatment of metastatic melanoma (MM). Although ICB is particularly successful in some MM patients, more than half do not obtain a durable benefit. Biomarkers that predict response are urgently needed and overcoming intrinsic resistance is key to improving the success of ICB therapy. Using single cell RNA sequencing, we characterized the immune landscape of pre- and early on-treatment biopsies taken from a cohort of MM patients (n>20) exposed to ICB therapy. Our analysis identified >20 immune cell types and confirmed previously described associations between the abundance of various CD8 T cell populations and ICB outcome. Unexpectedly, we found that lack of response was associated with an increased occurrence of a granulysin-expressing (GNLY+) natural killer (NK) cell population. This observation was replicated in other MM cohorts and in a breast cancer cohort in which paired biopsies were also collected pre and early-on ICB therapy. Spatial proteomics revealed that whereas NK cells colocalized with CD8 T cells within the tumour bed in responding lesions, these cells accumulated at the tumour margin in non-responding lesions. Strikingly, depletion of NK cells in an NRAS-driven melanoma mouse model, which exhibits an immune-excluded phenotype and is refractory to ICB, promoted massive immune cell infiltration and tumour clearance upon anti-PD1 exposure. These data highlight a differential immune cell topography between early on-treatment responding and nonresponding MM lesions, which could be exploited to develop a robust stratification biomarker, and unravel an unexpected contribution of NK cells in primary resistance to ICB.