ABSTRACT The prevailing model of steroid hormone nuclear receptor function assumes ligand-induced homodimer formation followed by binding to DNA hormone response elements (HREs). This model has been challenged by evidence showing that the glucocorticoid receptor (GR) forms tetramers upon ligand and DNA binding, which then drive receptor-mediated gene transactivation and transrepression. GR and the closely-related mineralocorticoid receptors (MR) interact to transduce corticosteroid hormone signaling, but whether they share the same quaternary arrangement is unknown. Here, we used a fluorescence imaging technique, Number & Brightness, to study oligomerization in a cell system allowing real-time analysis of receptor-DNA interactions. Agonist-bound MR forms tetramers in the nucleoplasm and higher order oligomers upon binding to HREs. Antagonists form intermediate quaternary arrangements, suggesting that large oligomers are essential for function. Divergence between MR and GR quaternary structure is driven by different functionality of known and new multimerization interfaces, which does not preclude formation of heteromers. Thus, influencing oligomerization may be important to selectively modulate corticosteroid signaling.

Abstract Mechanotransduction describes how cells perceive their mechanical environment and mechanosensitive ion channels are important for this process. ENaC (epithelial Na + channel)/DEG (degenerin) proteins form mechanosensitive ion channels and it is hypothesized their interaction with the extracellular matrix (ECM) via ‘tethers’ is required for mechanotransduction. Channels formed by vertebrate α, β and γ ENaC proteins are activated by shear force (SF) and mediate electrolyte/fluid-homeostasis and blood pressure regulation. Here, we report an interdependent activity of ENaC and the ECM that mediates SF effects in murine arteries and heterologously expressed channels. Furthermore, replacement of conserved extracellular N -glycosylated asparagines of αENaC decreased the SF response indicating that the attached N -glycans provide a connection to the ECM. Insertion of N -glycosylation sites into a channel subunit, innately lacking these motifs, increased its SF response. These experiments confirm an interdependent channel/ECM activity of mechanosensitive ENaC channel and highlight the role of channel N -glycans as new constituents for the translation of mechanical force into cellular signals.

The glucocorticoid and mineralocorticoid receptors (GR and MR, respectively) have distinct, yet overlapping physiological and pathophysiological functions. There are indications that both receptors interact functionally and physically, but the precise role of this interdependence is poorly understood. Here, we analyzed the impact of GR co-expression on MR genome-wide chromatin binding and transcriptional responses to aldosterone and glucocorticoids, both physiological ligands of this receptor. Our data show that GR co-expression alters MR genome-wide binding to consensus DNA sequences in a locus- and ligand-specific way. MR binding to consensus DNA sequences is affected by GR. Transcriptional responses of MR in the absence of GR are weak and show poor correlation with chromatin binding. In contrast, co-expression of GR potentiates MR-mediated transcription, particularly in response to aldosterone. Finally, single-molecule tracking of MR suggests that the presence of GR contributes to productive binding of MR/aldosterone complexes to chromatin. Together, our data indicate that co-expression of GR potentiates aldosterone-mediated MR transcriptional activity, even in the absence of glucocorticoids.

ABSTRACT The serum and glucocorticoid-induced kinase 1 (SGK1) stimulates aldosterone-dependent renal Na + reabsorption and modulates blood pressure. In addition, genetic ablation or pharmacological inhibition of SGK1 limits the development of kidney inflammation and fibrosis in response to excess mineralocorticoid signalling. In this work we tested the hypothesis that a systemic increase in SGK1 activity would potentiate mineralocorticoid/salt-induced hypertension and kidney injury. To that end, we used a transgenic mouse model with increased SGK1 activity. Mineralocorticoid/salt-induced hypertension and kidney damage was induced by unilateral nephrectomy and treatment with deoxycorticosterone acetate and NaCl in drinking water for six weeks. Our results demonstrate higher systolic blood pressure in treated transgenic mice when compared to wild type counterparts. Transgenic mice showed a mild increase in glomerular filtration rate, increased albuminuria, exacerbated glomerular hypertrophy and fibrosis. Transcriptomic analysis showed that extracellular matrix and immune response related terms were enriched in the downregulated and upregulated genes, respectively, in transgenic mice. In conclusion, we propose that systemically increased SGK1 activity is a risk factor for the development of mineralocorticoid-dependent hypertension and incipient kidney injury in the context of low renal mass.

Early termination of status epilepticus affords protection against brain damage and associated pathologies. Regulation of Kv7.2/7.3 potassium channels, underlying the neuronal M-current, is key for seizure control. This conductance is maintained during initiation of action potentials, affecting neuronal excitability and thus inhibiting epileptic discharges. The M-current is upregulated by the neuronal isoform of the serum and glucocorticoid-regulated kinase SGK1 (SGK1.1). We tested whether SGK1.1 is an anticonvulsant factor using the kainic acid (KA) model of acute seizures in a transgenic mouse model with expression of a constitutively active form of the kinase. Our results demonstrate that SGK1.1 confers robust protection against seizures associated to lower mortality levels, independently of sex or genetic background. SGK1.1-dependent protection results in reduced number, shorter duration, and early termination of EEG seizures. At the cellular level, it is associated to increased M-current amplitude mediated by Nedd4-2 phosphorylation, leading to decreased excitability of hippocampal CA1 neurons without alteration of basal synaptic transmission. Altogether, our results reveal that SGK1.1-mediated M-current upregulation in the hippocampus is a key component of seizure resistance in the KA epileptic paradigm, suggesting that regulation of this anticonvulsant pathway may improve adverse outcomes to status epilepticus, constituting a potential target for antiepileptic drugs.

ABSTRACT In the central nervous system, the M-current plays a critical role in regulating subthreshold electrical excitability of neurons, determining their firing properties and responsiveness to synaptic input. The M-channel is mainly formed by subunits Kv7.2 and Kv7.3 that co-assemble to form a heterotetrametric channel. Mutations in Kv7.2 and Kv7.3 are associated with hyperexcitability phenotypes including benign familial neonatal epilepsy (BFNE) and neonatal epileptic encephalopathy (NEE). SGK1.1, the neuronal isoform of the serum and glucocorticoids-regulated kinase 1 (SGK1), increases M-current density in neurons, leading to reduced excitability and protection against seizures. Herein, using two-electrode voltage clamp on Xenopus laevis oocytes, we demonstrate that SGK1.1 selectively activates heteromeric Kv7 subunit combinations underlying the M-current. Importantly, activated SGK1.1 is able to up-regulate M-channel activity in the presence of two different epilepsy mutations found in Kv7.2 subunit, R207W and A306T. In addition, proximity ligation assays in the N2a cell line allowed us to address the effect of these mutations on Kv7-SGK1.1-Nedd4 molecular associations, a proposed pathway underlying M-channel up-regulation by SGK1.1

Abstract BK channels are high-conductance potassium channels that are activated by voltage and Ca 2+ . The pore-forming α-subunits form homotetramers including a membrane-spanning domain and a cytosolic domain with a tandem of RCK-like domains (RCK1 and RCK2) per subunit. The eight RCKs compose high affinity Ca2+-binding sites that drive channel activation. Full-length Cryo-EM structures revealed intersubunit interactions between the RCK domains. Asparagine 449 (N449, human BK channel) is located at the RCK1 domain and coordinates Ca 2+ in the RCK2 of the adjacent subunit. In addition, two Arginines (R786 and R790) of one RCK2 and Glutamate 955 of the adjacent subunit constitute an additional interaction interface. Functional studies on these residues showed that these two interfaces are crucial in Ca 2+ sensitivity. To detect structural rearrangements induced by Ca 2+ during channel activation, we took advantage of the photoactivatable unnatural amino acid p-benzoyl-L-phenylalanine (BzF). Functional channels were obtained with this amino acid inserted at 11 positions. N449 and R786 positions (N449BzF and R786BzF respectively). UV-induced photocrosslinking led to Ca 2+ dependent and voltage-independent effects in both mutants. N449BzF showed a steady-state current reduction at saturating Ca 2+ concentrations. Our data shows that this effect mainly relies on full occupancy of the RCK1 Ca 2+ binding site, since mutation of this site abolished the effect. The R786BzF construct showed a substantial potentiation of the current in the absence of Ca 2+ . In this case, photocrosslinking seems to favor the activation of the channel by voltage. Overall, these results suggest mobile interfaces between RCK domains are key to BK channel activation.

Epilepsy is a neurological condition associated to significant brain damage produced by status epilepticus (SE) including neurodegeneration, gliosis and ectopic neurogenesis. Reduction of these processes constitutes a useful strategy to improve recovery and ameliorate negative outcomes after an initial insult. SGK1.1, the neuronal isoform of the serum and glucocorticoids-regulated kinase 1 (SGK1), has been shown to increase M-current density in neurons, leading to reduced excitability and protection against seizures. We now show that SGK1.1 activation potently reduces levels of neuronal death and gliosis after SE induced by kainate, even in the context of high seizure activity. This neuroprotective effect is not exclusively a secondary effect of M-current activation but is also directly linked to decreased apoptosis levels through regulation of Bim and Bcl-xL cellular levels. Our results demonstrate that this newly described antiapoptotic role of SGK1.1 activation acts synergistically with the regulation of cellular excitability, resulting in a significant reduction of SE-induced brain damage. The protective role of SGK1.1 occurs without altering basal neurogenesis in brain areas relevant to epileptogenesis.