Many industrial chemicals that are produced from fossil resources could be manufactured more sustainably through fermentation. Here we describe the development of a carbon-negative fermentation route to producing the industrially important chemicals acetone and isopropanol from abundant, low-cost waste gas feedstocks, such as industrial emissions and syngas. Using a combinatorial pathway library approach, we first mined a historical industrial strain collection for superior enzymes that we used to engineer the autotrophic acetogen Clostridium autoethanogenum. Next, we used omics analysis, kinetic modeling and cell-free prototyping to optimize flux. Finally, we scaled-up our optimized strains for continuous production at rates of up to ~3 g/L/h and ~90% selectivity. Life cycle analysis confirmed a negative carbon footprint for the products. Unlike traditional production processes, which result in release of greenhouse gases, our process fixes carbon. These results show that engineered acetogens enable sustainable, high-efficiency, high-selectivity chemicals production. We expect that our approach can be readily adapted to a wide range of commodity chemicals.

Abstract Carbon-negative synthesis of biochemical products has the potential to mitigate global CO 2 emissions. An attractive route to do this is the reverse β-oxidation (r-BOX) pathway coupled to the Wood-Ljungdahl pathway. Here, we optimized and implemented r-BOX for the synthesis of C4-C6 acids and alcohols. With a high-throughput in vitro prototyping workflow, we screened 762 unique pathway combinations using cell-free extracts tailored for r-BOX to identify enzyme sets for enhanced product selectivity. Implementation of these pathways into Escherichia coli generated designer strains for the selective production of butanoic acid (4.9 ±0.1 gL -1 ), hexanoic acid (3.06 ± 0.03 gL -1 ) and 1-hexanol (1.0 ± 0.1 gL -1 ) at the best performance reported to date in this bacterium. We also generated Clostridium autoethanogenum strains able to produce 1-hexanol from syngas, achieving a titer of 0.26 gL -1 in a 1.5-L continuous fermentation. Our strategy enables optimization of rBOX derived products for biomanufacturing and industrial biotechnology.

Microbes able to convert gaseous one-carbon (C1) waste feedstocks are increasingly important to transition to the sustainable production of renewable chemicals and fuels. Acetogens are interesting biocatalysts since gas fermentation using Clostridium autoethanogenum has been commercialised. However, most acetogen strains need complex nutrients, display slow growth, and are not robust for bioreactor fermentations. In this work, we used three different and independent adaptive laboratory evolution (ALE) strategies to evolve the wild-type C. autoethanogenum to grow faster, without yeast extract and to be robust in operating continuous bioreactor cultures. Multiple evolved strains with improved phenotypes were isolated on minimal media with one strain, named "LAbrini", exhibiting superior performance regarding the maximum specific growth rate, product profile, and robustness in continuous cultures. Whole-genome sequencing of the evolved strains identified 25 mutations. Of particular interest are two genes that acquired seven different mutations across the three ALE strategies, potentially as a result of convergent evolution. Reverse genetic engineering of mutations in potentially sporulation-related genes CLAU_3129 (spo0A) and CLAU_1957 recovered all three superior features of our ALE strains through triggering significant proteomic rearrangements. This work provides a robust C. autoethanogenum strain "LAbrini" to accelerate phenotyping and genetic engineering and to better understand acetogen metabolism.

Abstract Background Prostate cancer diagnosis and prognosis is currently limited by the availability of sensitive and specific biomarkers. There is an urgent need to develop molecular biomarkers that allow for the distinction of indolent from aggressive disease, the sensitive detection of heterogeneous tumors, or the evaluation of micro-metastases. The availability of multi-omics datasets in publicly accessible databases provides a valuable foundation to develop computational workflows for the identification of suitable biomarkers for clinical management of cancer patients. Results We combined transcriptomic data of primary localized and advanced prostate cancer from two cancer databases. Transcriptomic analysis of metastatic tumors unveiled a distinct overexpression pattern of genes encoding cell surface proteins intricately associated with cell-matrix components and chemokine signaling pathways. Utilizing an integrated approach combining machine learning and weighted gene correlation network modules, we identified the EZH2-TROAP axis as the main trajectory from initial tumor development to lethal metastatic disease. In addition, we identified and independently validated 58 promising biomarkers that were specifically upregulated in primary localized or metastatic disease. Among those biomarkers, 22 were highly significant for predicting biochemical recurrence. Notably, we confirmed TPX2 upregulation at the protein level in an independent cohort of primary prostate cancer and matched lymph node metastases. Conclusions This study demonstrates the effectiveness of using advanced bioinformatics approaches to identify the biological factors that drive prostate cancer progression. Furthermore, the targets identified show promise as prognostic biomarkers in clinical settings. Thus, integrative bioinformatics methods provide both deeper understanding of disease dynamics and open the doors for future personalized interventions.

Abstract Patient-derived organoid (PDO) cancer models are generated from epithelial tumor cells. Although they reflect the molecular tumor characteristics, they lack the complexity of the tumor microenvironment, which is a key driver of tumorigenesis and therapy response. Here, we present a colorectal cancer (CRC) organoid model that incorporates epithelial cells and stromal fibroblasts from the same patient. Molecular characterization of primary cancer associated fibroblasts (CAFs) and matched normal fibroblasts (NF) revealed proteomic, secretome and gene expression differences in pathways associated with tumor related fibroblast function. Further, CAFs retained higher motility compared to NFs in vitro . Importantly, both CAFs and NFs supported cancer cell proliferation in 3D co-cultures, without the addition of classical niche factors. PDOs grown together with fibroblasts displayed a larger cellular heterogeneity of tumor cells compared to mono-cultures, and closely resembled the in vivo tumor morphology. This was also confirmed by the calculation of cellular proportions of epithelial cell subtypes in organoid mono-versus co-cultures, which were inferred through bioinformatics deconvolution of bulk RNA sequencing data using published single cell RNA sequencing datasets from CRC tissues. Additionally, we observed a mutual crosstalk between tumor cells and fibroblasts in the co-cultures. This was manifested by majorly deregulated pathways such as cell-cell communication and extracellular matrix remodeling in the organoids. For the fibroblasts, we observed enhanced expression of tumor induced marker genes and cytokines characteristic for myo- and immunogenic fibroblasts. This model will be vital as a physiological personalized tumor model to study disease mechanisms and therapy response in CRC. One Sentence Summary Patient matched fibroblasts support tumor organoid growth in 3D co-culture and maintain intratumoral cellular heterogeneity and histo-morphology.

ABSTRACT Microbes able to convert gaseous one-carbon (C1) waste feedstocks are of growing importance in transitioning to the biosustainable production of renewable chemicals and fuels. Acetogens are particularly interesting biocatalysts since gas fermentation using Clostridium autoethanogenum has already been commercialised. Most non-commercial acetogen strains, however, need complex nutrients, display slow growth, and are not sufficiently robust for routine bioreactor fermentations. In this work, we used three adaptive laboratory evolution (ALE) strategies to evolve the wild-type model-acetogen C. autoethanogenum to grow faster, without complex nutrients and to be robust in operation of continuous bioreactor cultures. Seven evolved strains with improved phenotypes were isolated on minimal medium with one strain, named “LAbrini” (LT1), exhibiting superior performance in terms of the maximum specific growth rate, product profile, and robustness in continuous cultures. Differing performance of the strains between bottle batch and continuous cultures shows the importance of testing novel strains in industrially relevant continuous fermentation conditions. Interestingly, a very distinct transcriptome profile linked to a potential CO toxicity phenotype was observed in bioreactor cultures for one evolved strain. Whole-genome sequencing of the seven evolved strains identified 25 mutations with two genomic regions under stronger evolutionary pressure. Our analysis also suggests that the genotypic changes that are potentially responsible for the improved phenotypes may serve as useful candidates for metabolic engineering of cell factories. This work provides the robust C. autoethanogenum strain LAbrini to the academic community to speed up phenotyping and genetic engineering, improve quantitative characterisation of acetogen metabolism, and facilitate the generation of high-quality steady-state datasets.

Transforming growth factor beta (TGF-β) exhibits complex and context-dependent cellular responses. While it mostly induces tumor-suppressive effects in early stages of tumorigenesis, its tumor promoting properties are evident in advanced disease. This TGF-β duality is still not fully understood, and whether TGF-β supports invasion and metastasis by influencing cancer cells directly, or rather through the stromal tumor compartment remains a matter of debate. Here, we utilized a library of colorectal cancer (CRC) patient-derived tumoroids (PDTs), representing a spectrum of tumor stages, to study cancer cell-specific responses to TGF-β. Using medium conditions allowing for the differentiation of PDTs, we observed TGF-β induced tumor-suppressive effects in early-stage tumoroids. PDTs with TGF-β pathway mutations or PDTs derived from metastatic tumors were insensitive to the treatment. Notably, one tumoroid line harboring an atypical KRAS Q22K mutation underwent partial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), associated with morphological changes and increased invasiveness. On a molecular level, this was accompanied by elevated expression of mesenchymal genes, as well as deregulation of pathways associated with matrix remodeling and cell adhesion. Our results suggest that tumor cell intrinsic responses to TGF-β are critical in determining its tumor-suppressive or -promoting effects