Transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) is a potent fibrotic factor responsible for the synthesis of extracellular matrix. TGF-beta1 acts through the TGF-beta type I and type II receptors to activate intracellular mediators, such as Smad proteins, the p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), and the extracellular signal-regulated kinase pathway. We expressed the kinase domain of the TGF-beta type I receptor [activin receptor-like kinase (ALK)5] and the substrate, Smad3, and determined that SB-431542 is a selective inhibitor of Smad3 phosphorylation with an IC50 of 94 nM. It inhibited TGF-beta1-induced nuclear Smad3 localization. The p38 mitogen-activated protein kinase inhibitors SB-203580 and SB-202190 also inhibit phosphorylation of Smad3 by ALK5 with IC50 values of 6 and 3 microM, respectively. This suggests that these p38 MAPK inhibitors must be used at concentrations of less than 10 microM to selectively address p38 MAPK mechanisms. However, the p38 MAPK inhibitor SB-242235 did not inhibit ALK5. To evaluate the relative contribution of Smad signaling and p38 MAPK signaling in TGF-beta1-induced matrix production, the effect of SB-431542 was compared with that of SB-242235 in renal epithelial carcinoma A498 cells. All compounds inhibited TGF-beta1-induced fibronectin (FN) mRNA, indicating that FN synthesis is mediated in part via the p38 MAPK pathway. In contrast, SB-431542, but not the selective p38 MAPK inhibitor SB-242235, inhibited TGF-beta1-induced collagen Ialpha1 (col Ialpha1). These data indicate that some matrix markers that are stimulated by TGF-beta1 are mediated via the p38 MAPK pathway (i.e., FN), whereas others seem to be activated via ALK5 signaling independent of the p38 MAPK pathway (i.e., col Ialpha1).

Bacteria use a variety of secreted virulence factors to manipulate host cells, thereby causing significant morbidity and mortality. We report a mechanism for the long-distance delivery of multiple bacterial virulence factors, simultaneously and directly into the host cell cytoplasm, thus obviating the need for direct interaction of the pathogen with the host cell to cause cytotoxicity. We show that outer membrane–derived vesicles (OMV) secreted by the opportunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa deliver multiple virulence factors, including β-lactamase, alkaline phosphatase, hemolytic phospholipase C, and Cif, directly into the host cytoplasm via fusion of OMV with lipid rafts in the host plasma membrane. These virulence factors enter the cytoplasm of the host cell via N-WASP–mediated actin trafficking, where they rapidly distribute to specific subcellular locations to affect host cell biology. We propose that secreted virulence factors are not released individually as naked proteins into the surrounding milieu where they may randomly contact the surface of the host cell, but instead bacterial derived OMV deliver multiple virulence factors simultaneously and directly into the host cell cytoplasm in a coordinated manner.

Abstract Shotgun sequencing of cultured microbial isolates/individual eukaryotes (whole-genome sequencing) and microbial communities (metagenomics) has become commonplace in biology. Very often, sequenced samples encompass organisms spanning multiple domains of life, necessitating increasingly elaborate software for accurate taxonomic classification of assembled sequences. While many software tools for taxonomic classification exist, SprayNPray offers a quick and user-friendly, semiautomated approach, allowing users to separate contigs by taxonomy (and other metrics) of interest. Easy installation, usage, and intuitive output, which is amenable to visual inspection and/or further computational parsing, will reduce barriers for biologists beginning to analyze genomes and metagenomes. This approach can be used for broad-level overviews, preliminary analyses, or as a supplement to other taxonomic classification or binning software. SprayNPray profiles contigs using multiple metrics, including closest homologs from a user-specified reference database, gene density, read coverage, GC content, tetranucleotide frequency, and codon-usage bias. The output from this software is designed to allow users to spot-check metagenome-assembled genomes, identify, and remove contigs from putative contaminants in isolate assemblies, identify bacteria in eukaryotic assemblies (and vice-versa), and identify possible horizontal gene transfer events.

Abstract People with the genetic disorder cystic fibrosis (CF) harbor lifelong respiratory infections, with morbidity and mortality frequently linked to chronic lung infections dominated by the opportunistically pathogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa . During chronic CF lung infections, a single clone of P. aeruginosa can persist for decades and dominate end-stage CF lung disease due to its propensity to adaptively evolve to the respiratory environment, a process termed “pathoadaptation”. Chronic rhinosinusitis (CRS), chronic inflammation and infection of the sinonasal space, is highly prevalent in CF and the sinuses may serve as the first site in the respiratory tract to become colonized by bacteria that then proceed to seed lung infections. We identified three evolutionary genetic routes by which P. aeruginosa evolves in the sinuses of people with CF, including through the evolution of mutator lineages and proliferative insertion sequences and culminating in early genomic signatures of host-restriction. Our findings raise the question of whether a significant portion of the pathoadaptive phenotypes previously thought to have evolved in response to selective pressures in the CF lungs may have first arisen in the sinuses and underscore the link between sinonasal and lung disease in CF. Graphical abstract and highlights Pseudomonas aeruginosa undergoes adaptive evolution in the sinuses of people with CF Over time, pathoadapted strains display early signatures of genome degradation consistent with recent host restriction Mutations previously thought to occur in CF lungs may have first evolved in sinuses

Abstract Staphylococcus aureus can complicate preceding viral infections, including influenza virus. A bacterial infection combined with a preceeding viral infection, known as super-infection, leads to worse outcomes compared to single infection. Most of the super-infection literature focuses on the changes in immune responses to bacteria between homeostatic and virally infected lungs. However, it is unclear how much of an influence bacterial virulence factors have in super-infection. Staphylococcal species express a broad range of cell wall-anchored proteins (CWAs) that have roles in host adhesion, nutrient acquisition, and immune evasion. We screened the importance of these CWAs using mutants lacking individual CWAs in vivo in both bacterial pneumonia and influenza super-infection. In bacterial pneumonia, lacking individual CWAs led to varying decreases in bacterial burden, lung damage, and immune infiltration into the lung. However, the presence of a preceding influenza infection partially abrogated the requirement for CWAs. In the screen, we found that the uncharacterized CWA S. aureus surface protein D (SasD) induced changes in both inflammatory and homeostatic lung markers. We further characterized a SasD mutant (sasD A50.1) in the context of pneumonia. Mice infected with sasD A50.1 had decreased bacterial burden, inflammatory responses, and mortalty compared to wildtype S. aureus . Mice also had reduced levels of IL-1β compared with wildtype, likely derived from macrophages. Reductions in IL-1β transcript levels as well as increased macrophage viability implicate altered macrophage cell death pathways. These data identify a novel virulence factor for S. aureus that influences inflammatory signaling within the lung. Importance Staphylococcus aureus is a common commensal bacteria that can cause severe infections, such as pneumonia. In the lung, viral infections increase the risk of staphylococcal pneumonia, leading to combined infections known as super-infections. The most common virus associated with S. aureus pneumonia is influenza, and super-infections lead to worse patient outcomes compared to either infection alone. While there is much known about how the immune system differs between healthy and virally infected lungs, the role of bacterial virulence factors in super-infection is less understood. The significance of our research is identifying new bacterial virulence factors that play a role in the initiation of infection and lung injury, which could lead to future therapies to prevent pulmonary single or super-infection with S. aureus .

Abstract Pseudomonas aeruginosa infections can be difficult to treat and new therapeutic approaches are needed. Bacteriophage therapy is a promising alternative to traditional antibiotics, but large numbers of isolated and characterized phages are lacking. We collected 23 genetically and phenotypically diverse P. aeruginosa isolates from people with cystic fibrosis (CF) and clinical infections, and characterized their genetic, phenotypic, and prophage diversity. We then used these isolates to screen and isolate 14 new P. aeruginosa -targeting phages from hospital wastewater. Phages were characterized with genome sequencing, comparative genomics, and lytic activity screening against all 23 bacterial host isolates. For four different phages, we evolved bacterial mutants that were resistant to phage infection. We then used genome sequencing and functional analysis of the resistant mutants to study their mechanisms of phage resistance as well as changes in virulence factor production and antibiotic resistance, which differed from corresponding parent bacterial isolates. Finally, we tested two phages for their ability to kill P. aeruginosa grown in biofilms in vitro , and observed that both phages reduced viable bacteria in biofilms by least one order of magnitude. One of these phages also showed activity against P. aeruginosa biofilms grown on CF airway epithelial cells. Overall, this study demonstrates how systematic genomic and phenotypic characterization can be deployed to develop bacteriophages as precision antibiotics.

Abstract Mucosa-associated biofilms are associated with many human disease states, but the mechanisms by which the host promotes biofilm biogenesis remain unclear. In chronic respiratory diseases like cystic fibrosis (CF), Pseudomonas aeruginosa establishes chronic infection through biofilm formation. P. aeruginosa can be attracted to interspecies biofilms through potassium currents emanating from the biofilms. We hypothesized that P. aeruginosa could, similarly, sense and respond to the potassium efflux from human airway epithelial cells (AECs) to promote biofilm biogenesis. Using respiratory epithelial co-culture biofilm imaging assays of P. aeruginosa grown in association with CF bronchial epithelial cells (CFBE41o - ), we found that P. aeruginosa biofilm biogenesis was increased by potassium efflux from AECs, as examined by potentiating large conductance potassium channel, BK Ca (NS19504) potassium efflux. This phenotype is driven by increased bacterial attachment and increased coalescence of bacteria into aggregates. Conversely, biofilm formation was reduced when AECs were treated with a BK Ca blocker (paxilline). Using an agar-based macroscopic chemotaxis assay, we determined that P. aeruginosa chemotaxes toward potassium and screened transposon mutants to discover that disruption of the high-sensitivity potassium transporter, KdpFABC, and the two-component potassium sensing system, KdpDE, reduces P. aeruginosa potassium chemotaxis. In respiratory epithelial co-culture biofilm imaging assays, a KdpFABCDE deficient P. aeruginosa strain demonstrated reduced biofilm growth in association with AECs while maintaining biofilm formation on abiotic surfaces. Collectively, these data suggest that P. aeruginosa biofilm formation can be increased by attracting bacteria to the mucosal surface via a potassium gradient and enhancing coalescence of single bacteria into microcolonies through aberrant AEC potassium efflux sensed through the bacterial KdpFABCDE system. These findings suggest that electrochemical signaling from the host can amplify biofilm biogenesis, a novel host-pathogen interaction, and that potassium flux could be a potential target for therapeutic intervention to prevent chronic bacterial infections in diseases with mucosa-associated biofilms, like CF. Author Summary Biofilm formation is important for Pseudomonas aeruginosa to cause chronic infections on epithelial surfaces during respiratory diseases, like cystic fibrosis (CF). The host factors that promote biofilm formation on host surfaces are not yet fully understood. Potassium signals from biofilms can attract P. aeruginosa , but it is unknown if potassium from the human cells can influence P. aeruginosa biofilm formation on a host surface. We found that P. aeruginosa biofilm formation on human airway cells can be increased by the potassium currents from airway cells, and determined bacterial genes related to potassium uptake and sensing that contribute to biofilm formation on airway cells. These findings suggest that P. aeruginosa can respond to host potassium signals by forming increased biofilm and that reducing chronic infections may be accomplished by reducing potassium coming from airway cells or blocking the bacterial proteins responsible for the biofilm enhancement by potassium currents.

Mucosa-associated biofilms are associated with many human disease states, but the host mechanisms promoting biofilm remain unclear. In chronic respiratory diseases like cystic fibrosis (CF), Pseudomonas aeruginosa establishes chronic infection through biofilm formation. P . aeruginosa can be attracted to interspecies biofilms through potassium currents emanating from the biofilms. We hypothesized that P . aeruginosa could, similarly, sense and respond to the potassium efflux from human airway epithelial cells (AECs) to promote biofilm. Using respiratory epithelial co-culture biofilm imaging assays of P . aeruginosa grown in association with CF bronchial epithelial cells (CFBE41o - ), we found that P . aeruginosa biofilm was increased by potassium efflux from AECs, as examined by potentiating large conductance potassium channel, BK Ca (NS19504) potassium efflux. This phenotype is driven by increased bacterial attachment and increased coalescence of bacteria into aggregates. Conversely, biofilm formation was reduced when AECs were treated with a BK Ca blocker (paxilline). Using an agar-based macroscopic chemotaxis assay, we determined that P . aeruginosa chemotaxes toward potassium and screened transposon mutants to discover that disruption of the high-sensitivity potassium transporter, KdpFABC, and the two-component potassium sensing system, KdpDE, reduces P . aeruginosa potassium chemotaxis. In respiratory epithelial co-culture biofilm imaging assays, a KdpFABCDE deficient P . aeruginosa strain demonstrated reduced biofilm growth in association with AECs while maintaining biofilm formation on abiotic surfaces. Furthermore, we determined that the Kdp operon is expressed in vivo in people with CF and the genes are conserved in CF isolates. Collectively, these data suggest that P . aeruginosa biofilm formation can be increased by attracting bacteria to the mucosal surface and enhancing coalescence into microcolonies through aberrant AEC potassium efflux sensed by the KdpFABCDE system. These findings suggest host electrochemical signaling can enhance biofilm, a novel host-pathogen interaction, and potassium flux could be a therapeutic target to prevent chronic infections in diseases with mucosa-associated biofilms, like CF.

Coinfection with two notorious opportunistic pathogens, the Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Staphylococcus aureus , dominates chronic pulmonary infections. While coinfection is associated with poor patient outcomes, the interspecies interactions responsible for such decline remain unknown. Here, we dissected molecular mechanisms of interspecies sensing between P. aeruginosa and S. aureus . We discovered that P. aeruginosa senses S. aureus secreted peptides and, counterintuitively, moves towards these toxins. P. aeruginosa tolerates such a strategy through "competition sensing", whereby it preempts imminent danger/competition by arming cells with type six secretion (T6S) and iron acquisition systems. Intriguingly, while T6S is predominantly described as weaponry targeting Gram-negative and eukaryotic cells, we find that T6S is essential for full P. aeruginosa competition with S. aureus , a previously undescribed role for T6S. Importantly, competition sensing was activated during coinfection of bronchial epithelia, including T6S islands targeting human cells. This study reveals critical insight into both interspecies competition and how antagonism may cause collateral damage to the host environment.

ABSTRACT Elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor (ETI) therapy has revolutionized the treatment of cystic fibrosis (CF) for most affected individuals but the effects of treatment on sinus microbiota are still unknown. Changes to the airway microbiota in CF are associated with disease state and alterations to the bacterial community after ETI initiation may require changes to clinical management regimens. We collected sinus swab samples from the middle meatus in an observational study of 38 adults with CF and chronic rhinosinusitis (CRS) from 2017 to 2021 and captured the initiation of ETI therapy. We performed 16S and custom amplicon sequencing to characterize the sinus microbiota pre- and post-ETI. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed to estimate total bacterial abundance. Sinus samples from people with CF (pwCF) clustered into three community types, dependent on the dominant bacterial organism: a Pseudomonas -dominant, Staphylococcus -dominant, and mixed dominance cluster. Shannon’s diversity index was low and not significantly altered post-ETI. Total bacterial load was not significantly lowered post-ETI. Pseudomonas spp. abundance was significantly reduced post-ETI, but eradication was not observed. Staphylococcus spp. became the dominant organism in most individuals post-ETI and we showed the presence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in the sinus both pre- and post-ETI. We also demonstrated that the sinus microbiome is predictive of the presence of Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., and Serratia spp. in the sputum. Pseudomonas spp. and Staphylococcus spp., including MRSA, persist in the sinuses of pwCF after ETI therapy, indicating that these pathogens will continue to be important in CF airway disease management in the era of highly effective modulator therapies (HEMT). IMPORTANCE Highly effective modulator therapies (HEMT), such as elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor (ETI), for cystic fibrosis (CF) have revolutionized patient care and quality of life for most affected individuals. The effects of these therapies on the microbiota of the airways are still unclear, though work has already been published on changes to microbiota in the sputum. Our study presents evidence for reduced relative abundance of Pseudomonas spp. in the sinuses following ETI therapy. We also show that Staphylococcus spp. becomes the dominant organism in the sinus communities of most individuals in this cohort after ETI therapy. We identified methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in the sinus microbiota both pre- and post-therapy. These findings demonstrate that pathogen monitoring and treatment will remain a vital part of airway disease management for people with cystic fibrosis (pwCF) in the era of HEMT.