Abstract Protein–protein interactions (PPIs) mediate numerous essential functions and regulatory events in living organisms. The physical interactome of a protein can be abnormally altered in response to external and internal cues, thus modulating cell physiology and contributing to human disease. In particular, neurodegenerative diseases due to the accumulation of aberrantly folded and aggregated proteins may lead to alterations in protein interactomes. Identifying changes in the interactomes of normal and disease states of proteins could help to understand molecular disease mechanisms, but current interactomics methods are limited in the ability to pinpoint structure-specific PPIs and their interaction interfaces on a proteome-wide scale. Here, we adapted limited proteolysis–mass spectrometry (LiP–MS) to systematically identify putative structure-specific PPIs by probing protein structural alterations within cellular extracts upon treatment with specific structural states of a given protein. We demonstrate the feasibility of our method to detect well-characterized PPIs, including antibody–target protein interactions and interactions with membrane proteins, and show that it pinpoints PPI interfaces. We then applied the LiP–MS approach to study the structure-specific interactors of the Parkinson’s disease hallmark protein alpha-synuclein (aSyn). We identified several previously known interactors of both aSyn monomer and amyloid fibrils and provide a resource of novel putative structure-specific interactors for further studies. This approach is applicable to identify structure-specific interactomes of any protein, including posttranslationally modified and unmodified, or metabolite-bound and unbound structural states of proteins.

Abstract The Duffy antigen receptor, also known as FY glycoprotein or CD234, is a seven transmembrane protein expressed primarily at the surface of red blood cells, which displays promiscuous binding to multiple chemokines. Not only does it serve as the basis of the Duffy blood group system but it also acts as the primary attachment site for malarial parasite Plasmodium vivax on erythrocytes and as one of the nucleating receptors for the pore forming toxins secreted by Staphylococcus aureus . Despite a predicted 7TM architecture and efficient binding to a spectrum of chemokines, it fails to exhibit canonical second messenger response such as calcium release, likely due to a lack of G protein coupling. Unlike prototypical GPCRs and β-arrestin-biased atypical chemokine receptors, the Duffy antigen receptor also appears to lack β-arrestin binding, making it an enigmatic 7TM chemokine receptor. In order to decipher the molecular mechanism of this intriguing functional divergence exhibited by the Duffy antigen receptor, we have determined its cryo-EM structure in complex with a C-C type chemokine, CCL7. The structure reveals a relatively superficial binding mode of CCL7, with the N-terminus of the receptor serving as the key interaction interface, and a partially formed orthosteric binding pocket lacking the second site for chemokine recognition compared to prototypical chemokine receptors. The structural framework allows us to employ HDX-MS approach to uncover ligand-induced structural changes in the receptor and draw important insights into the promiscuous nature of chemokine binding. Interestingly, we also observe a dramatic shortening of TM5 and 6 on the intracellular side, compared to prototypical GPCRs, which precludes the coupling of canonical signal-transducers namely G proteins, GRKs and β-arrestins, as demonstrated through extensive cellular assays. Taken together, our study uncovers a previously unknown structural mechanism that imparts unique functional divergence on the 7TM fold encoded in the Duffy antigen receptor while maintaining its scavenging function and should facilitate the designing of novel therapeutics targeting this receptor.

Abstract Organic cation transporters (OCTs) facilitate the translocation of catecholamines and xenobiotics across the plasma membrane in various tissues throughout the human body. OCT3 plays a key role in low-affinity, high-capacity uptake of monoamines in most tissues including heart, brain and liver. Its deregulation plays a role in diseases. Despite its importance, the structural basis of OCT3 function and its inhibition has remained enigmatic. Here we describe the cryo-EM structure of human OCT3 at 3.2 Å resolution. Structures of OCT3 bound to two inhibitors, corticosterone and decynium-22, define the ligand binding pocket and reveal common features of major facilitator transporter inhibitors. In addition, we relate the functional characteristics of an extensive collection of previously uncharacterized human genetic variants to structural features, thereby providing a basis for understanding the impact of OCT3 polymorphisms.

Abstract Connexin gap junction channels and hemichannels play important roles in intercellular communication and signaling. Some of connexin isoforms are associated with diseases, including hereditary neuropathies, heart disease and cancer. Although small molecule inhibitors of connexins show promise as therapeutic agents, the molecular mechanisms of connexin channel inhibition are unknown. Here, we report the cryo-EM structure of connexin-36 (Cx36) bound to an anti-malarial drug mefloquine at 2.1 Å resolution. Six drug binding sites partially occlude the pore of each connexon forming the channel. Each drug molecule in the ring makes contacts with residues in the pore-lining pocket and with the neighbouring mefloquine molecules, partially occluding the pore and modifying the pore electrostatics, ultimately reducing solute translocation through the channel. Structures of Cx36 in the presence of quinine and quinidine show a similar mode of drug binding. Molecular dynamics simulations of Cx36 bound to mefloquine show that drug binding affects the kinetics of ion passage through the pore. This previously undescribed mode of connexin channel inhibition presents an opportunity for designing subtype-specific connexin inhibitors. One-sentence summary Mechanism of connexin channel inhibition by small molecules

Abstract Mycobacterium tuberculosis adenylyl cyclase (AC) Rv1625c / Cya is an evolutionary ancestor of the mammalian membrane ACs and a model system for studies of their structure and function. Although the vital role of ACs in cellular signaling is well established, the function of their transmembrane (TM) regions remains unknown. Here we describe the cryo-EM structure of Cya bound to a stabilizing nanobody at 3.6 Å resolution. The TM helices 1-5 form a structurally conserved domain that facilitates the assembly of the helical and catalytic domains. The TM region contains discrete pockets accessible from the extracellular and cytosolic side of the membrane. Neutralization of the negatively charged extracellular pocket Ex1 destabilizes the cytosolic helical domain and reduces the catalytic activity of the enzyme. The TM domain acts as a functional component of Cya, guiding the assembly of the catalytic domain and providing the means for direct regulation of catalytic activity in response to extracellular ligands. One-Sentence Summary Structure of M. tuberculosis membrane adenylyl cyclase Cya

Many gram-negative pathogenic bacteria use type III secretion system (T3SS) to inject virulence effectors directly into the cytosol of targeted host cells. Given that the protein unfolding requisite for secretion via nano-size pore of T3SS injectisome is an energetically unfavorable process, How do pathogenic bacteria unfold and secrete hundreds of toxic proteins in seconds remain largely unknown. In this study, first, from an in-depth analysis of folding and stability of T3SS effector ExoY, we show that the proton-concentration gradient (~pH 5.8-6.0) generated by proton-motive force (PMF) can significantly amortize tertiary structural folding and stability of effectors without significant entropic cost. Strikingly, it was found that the lower energetic cost associated with the global unfolding of ExoY is mainly due to its weakly folded geometry and abundance of geometrical frustrations stemming from buried water molecules and native-like folded intermediates in the folded cores. From in-silico structural analysis of 371 T3SS effectors, it can be curtained that T3SS effectors belong to typical class (disorder globules) of IDPs and have evolved similar conserved intrinsic structural archetypes to mediate early-stage unfolding. The slower folding kinetics in effector proteins requisite for efficient T3SS-mediated secretion mostly stems from reduced hydrophobic density and enhanced polar-polar repulsive interactions in their sequence landscapes. Lastly, the positively evolved histidine-mediated stabilizing interactions and gate-keeper residues in effector proteins shed light on collaborative role of evolved structural chemistry in T3SS effectors and PMF in the spatial-temporal regulation of effector folding and stability essential for maintaining balance in secretion and function trade-off.

Abstract Adenylyl cyclase 9 (AC9) is a membrane-bound enzyme that converts ATP into cAMP. The enzyme is weakly activated by forskolin, fully activated by the G protein Gαs subunit and is autoinhibited by the AC9 C-terminus. Although our recent structural studies of the AC9-Gαs complex provided the framework for understanding AC9 autoinhibition, the conformational changes that AC9 undergoes in response to activator binding remains poorly understood. Here, we present the cryo-EM structures of AC9 in several distinct states: (i) AC9 bound to a nucleotide inhibitor MANT-GTP, (ii) bound to an artificial activator (DARPin C4) and MANT-GTP, (iii) bound to DARPin C4 and a nucleotide analogue ATPαS, (iv) bound to Gαs and MANT-GTP. The artificial activator DARPin C4 partially activates AC9 by binding at a site that overlaps with the Gαs binding site. Together with the previously observed occluded and forskolin-bound conformations, structural comparisons of AC9 in the four new conformations show that secondary structure rearrangements in the region surrounding the forskolin binding site are essential for AC9 activation. One Sentence Summary Cryo-EM reveals activator-induced conformational changes in adenylyl cyclase AC9

Abstract Membrane adenylyl cyclase AC8 is regulated by G proteins and calmodulin (CaM), mediating the crosstalk between the cAMP pathway and Ca 2+ signalling. Despite the importance of AC8 in physiology, including cognitive functions and memory, the structural basis of its regulation by G proteins and CaM is not well defined. Here we report the 3.5 Å resolution cryo-EM structure of the bovine AC8 bound to Ca 2+ /CaM and the stimulatory Gαs protein. The structure reveals the architecture of the ordered AC8 domains bound to Gαs and a small molecule activator forskolin. The extracellular surface of AC8 features a negatively charged pocket, a potential site for unknown interactors. Despite the well resolved forskolin density, the captured state of AC8 does not favour tight nucleotide binding. The structural proteomics approaches, limited proteolysis and crosslinking mass spectrometry, allow us to identify the contact sites between AC8 and its regulators, CaM, Gαs, and Gβγ, as well as to infer the conformational changes induced by these interactions. Our results provide a framework for understanding the role of flexible regions in the mechanism of AC regulation.