The EZH2 histone methyltransferase is highly expressed in germinal center (GC) B cells and targeted by somatic mutations in B cell lymphomas. Here, we find that EZH2 deletion or pharmacologic inhibition suppresses GC formation and functions. EZH2 represses proliferation checkpoint genes and helps establish bivalent chromatin domains at key regulatory loci to transiently suppress GC B cell differentiation. Somatic mutations reinforce these physiological effects through enhanced silencing of EZH2 targets. Conditional expression of mutant EZH2 in mice induces GC hyperplasia and accelerated lymphomagenesis in cooperation with BCL2. GC B cell (GCB)-type diffuse large B cell lymphomas (DLBCLs) are mostly addicted to EZH2 but not the more differentiated activated B cell (ABC)-type DLBCLs, thus clarifying the therapeutic scope of EZH2 targeting.

ABSTRACT Mutations affecting enhancer chromatin regulators CREBBP and KMT2D are highly co-occurrent in germinal center (GC)-derived lymphomas and other tumors, even though regulating similar pathways. Herein, we report that combined haploinsufficiency of Crebbp and Kmt2d (C+K) indeed accelerated lymphomagenesis. C+K haploinsufficiency induced GC hyperplasia by altering cell fate decisions, skewing B cells away from memory and plasma cell differentiation. C+K deficiency particularly impaired enhancer activation for immune synapse genes involved in exiting the GC reaction. This effect was especially severe at super-enhancers for immunoregulatory and differentiation genes. Mechanistically, CREBBP and KMT2D formed a complex, were highly co-localized on chromatin, and were required for each-other’s stable recruitment to enhancers. Notably, C+K lymphomas in mice and humans manifested significantly reduced CD8 + T-cell abundance. Hence, deficiency of C+K cooperatively induced an immune evasive phenotype due at least in part to failure to activate key immune synapse super-enhancers, associated with altered immune cell fate decisions. SIGNIFICANCE Although CREBBP and KMT2D have similar enhancer regulatory functions, they are paradoxically co-mutated in lymphomas. We show that their combined loss causes specific disruption of super-enhancers driving immune synapse genes. Importantly, this leads to reduction of CD8 cells in lymphomas, linking super-enhancer function to immune surveillance, with implications for immunotherapy resistance.

Abstract Although CAR-T19 therapy is widely used for relapsed/refractory B cell lymphomas, approximately half of patients experience post CAR-T relapse. The mechanisms underlying this resistance remain largely unknown and efforts to overcome this limitation are hindered by the lack of suitable pre-clinical models for study. To address these unmet needs, we generated a novel genetically engineered mouse model with conditional expression of Ezh2Y641F and BCL2 in germinal center (GC) B cells. Ezh2/BCL2 mice developed follicular lymphoma (FL) which histologically and transcriptionally recapitulates human FL. Moreover, we established a cell line derived from an Ezh2/BCL2 mouse that developed transformed FL (tFL). Injection of the cell line named “tFL-P6” in immunocompetent C57BL6 recipients resulted in rapid disease progression that histologically and transcriptionally mimics human tFL. Treatment of tFL-P6 with EZH2 inhibitors (EZH2i) didn’t affect proliferation and viability, however, the number of pretreated cells was significantly reduced when co-cultured with T cells. EZH2i pretreated tFL-P6 displayed extended interaction with T cells, as measured by live imaging. EZH2i reprogrammed tFL-P6 to restore T cell engagement genes such as ICOSL, ICAM1, OX40L, and integrins, as well as cytokines and chemokines involved in T cell recruitment, therefore enhancing immunogenicity. Notably, pretreated tFL-P6 cells were rejected by C57BL6 whereas they developed lethal disease in immunodeficient recipients. Pre-treatment of tFL-P6 as well as human DLBCL and PDX-derived cell lines significantly enhanced CAR-T19 cell killing effects in vitro. Administering CAR-T cells in mice engrafted with EZH2i-pretreated tFL-P6 significantly reduced the tumor burden and prolonged their survival (100% vs 30%, p<0.01). To assess the direct interactions between lymphoma cells and CAR-T cells in vivo, we performed intravital 2-photon imaging of popliteal lymph nodes using dTomato labeled CAR-T cells and GFP+ tFL-P6 cells. Pretreatment of tFL-P6 cells with EZH2i doubled the recruitment of CAR-T cells in the microenvironment and enhanced the duration of contact and surface engagement with CAR-T cells. To explore the impact of EZH2 inhibition on CAR-T cells, we manufactured CAR-T cells from splenic T cells of mice treated with EZH2i or vehicle for 14 days. Prior exposure to EZH2i didn’t affect proliferation and transduction during CAR-T production. Ex vivo assays with those CAR-T cells and tFL-P6 cells showed a superior killing effect and expansion of EZH2i-exposed CAR-T (p<0.001). Mice bearing tFL-P6 lymphomas displayed a longer survival when infused with EZH2i-pretreated CAR-T cells (p=0.06). Pretreatment with EZH2i resulted in an increased memory/effector ratio (p<0.01) and reduction of PD1+CD38+ exhausted CD8CAR-T cells (p<0.001). Overall, EZH2i improved CAR-T therapy by enhancing lymphoma cell immunogenicity and CAR-T cell functions. These results prompted the initiation of a clinical trial to evaluate the safety and efficacy of this combination in R/R B cell lymphomas (NCT05934838). Citation Format: Yusuke Isshiki, Xi Chen, Matt Teater, Ioannis Karagiannidis, Henna Nam, Amy Chadburn, Ari Melnick, Wendy Béguelin. EZH2 inhibitors improve CAR-T therapy by enhancing lymphoma B cell immunogenicity and CAR-T cell functions [abstract]. In: Proceedings of the Fourth AACR International Meeting on Advances in Malignant Lymphoma: Maximizing the Basic-Translational Interface for Clinical Application; 2024 Jun 19-22; Philadelphia, PA. Philadelphia (PA): AACR; Blood Cancer Discov 2024;5(3_Suppl):Abstract nr PR01.

CREBBP mutations are highly recurrent in B-cell lymphomas and either inactivate its histone acetyltransferase (HAT) domain or truncate the protein. Herein, we show that these two classes of mutations yield different degrees of disruption of the epigenome, with HAT mutations being more severe and associated with inferior clinical outcome. Genes perturbed by CREBBP mutation are direct targets of the BCL6/HDAC3 onco-repressor complex. Accordingly, we show that HDAC3 selective inhibitors fully reverse CREBBP mutant aberrant epigenetic programming resulting in: a) growth inhibition of lymphoma cells through induction of BCL6 target genes such as CDKN1A and b) restoration of immune surveillance due to induction of BCL6 repressed IFN pathway and antigen presentation genes. By reactivating these genes, exposure to HDAC3-i restored the ability of tumor infiltrating lymphocytes to kill DLBCL cells in an MHC II and MHC I dependent manner. Hence HDAC3-i represent a novel mechanism-based immune-epigenetic therapy for CREBBP mutant lymphomas.