Abstract The epitranscriptomics field has undergone an enormous expansion in the last few years; however, a major limitation is the lack of generic methods to map RNA modifications transcriptome-wide. Here, we show that using direct RNA sequencing, N 6 -methyladenosine (m 6 A) RNA modifications can be detected with high accuracy, in the form of systematic errors and decreased base-calling qualities. Specifically, we find that our algorithm, trained with m 6 A-modified and unmodified synthetic sequences, can predict m 6 A RNA modifications with ~90% accuracy. We then extend our findings to yeast data sets, finding that our method can identify m 6 A RNA modifications in vivo with an accuracy of 87%. Moreover, we further validate our method by showing that these ‘errors’ are typically not observed in yeast ime4 -knockout strains, which lack m 6 A modifications. Our results open avenues to investigate the biological roles of RNA modifications in their native RNA context.

SUMMARY Motivation DNA and RNA modifications can now be identified using Nanopore sequencing. However, we currently lack a flexible software to efficiently encode, store, analyze and visualize DNA and RNA modification data. Results Here we present ModPhred , a versatile toolkit that facilitates DNA and RNA modification analysis from nanopore sequencing reads in a user-friendly manner. ModPhred integrates probabilistic DNA and RNA modification information within the FASTQ and BAM file formats, can be used to encode multiple types of modifications simultaneously, and its output can be easily coupled to genomic track viewers, facilitating the visualization and analysis of DNA and RNA modification information in individual reads in a simple and computationally efficient manner. Availability and Implementation ModPhred is available at https://github.com/novoalab/modPhred , is implemented in Python3, and is released under an MIT license. Supplementary Data Supplementary Data are available at Bioinformatics online.

ABSTRACT RNA modifications are dynamic chemical entities that regulate RNA fate, and an avenue for environmental response in neuronal function. However, which RNA modifications may be playing a role in neuronal plasticity and environmental responses is largely unknown. Here we characterize the biochemical function and cellular dynamics of two human RNA methyltransferases previously associated with neurological dysfunction, TRMT1 and its homolog, TRMT1- like (TRMT1L). Using a combination of next-generation sequencing, LC-MS/MS, patient-derived cell lines and knockout mouse models, we confirm the previously reported dimethylguanosine (m 2,2 G) activity of TRMT1 in tRNAs, as well as reveal that TRMT1L, whose activity was unknown, is responsible for methylating a subset of cytosolic tRNA Ala (AGC) isoacceptors at position 26. Using a cellular in vitro model that mimics neuronal activation and long term potentiation, we find that both TRMT1 and TRMT1L change their subcellular localization upon neuronal activation. Specifically, we observe a major subcellular relocalization from mitochondria and other cytoplasmic domains (TRMT1) and nucleoli (TRMT1L) to different small punctate compartments in the nucleus, which are as yet uncharacterized. This phenomenon does not occur upon heat shock, suggesting that the relocalization of TRMT1 and TRMT1L is not a general reaction to stress, but rather a specific response to neuronal activation. Our results suggest that subcellular relocalization of RNA modification enzymes play a role in neuronal plasticity and transmission of information, presumably by addressing new targets.

Abstract RNA polyadenylation plays a central role in RNA maturation, fate, and stability. In response to developmental cues, polyA tail lengths can vary, affecting the translation efficiency and stability of mRNAs. Here, we develop Nanopore 3’ end-capture sequencing (Nano3P-seq), a novel method that relies on nanopore cDNA sequencing to simultaneously quantify RNA abundance, tail composition and tail length dynamics at per-read resolution. By employing a template switching-based sequencing protocol, Nano3P-seq can sequence any given RNA molecule from its 3’ end, regardless of its polyadenylation status, without the need for PCR amplification or ligation of RNA adapters. We demonstrate that Nano3P-seq captures a wide diversity of RNA biotypes, providing quantitative estimates of RNA abundance and tail lengths in mRNA, lncRNA, sn/snoRNA, scaRNA, and rRNA molecules. We find that, in addition to mRNA and lncRNA, polyA tails can be identified in 16S mitochondrial rRNA in both mouse and zebrafish models. Moreover, we show that mRNA tail lengths are dynamically regulated during vertebrate embryogenesis at an isoform-specific level, correlating with mRNA decay. Finally, we identify non-A bases within polyA tails of various lengths and reveal their distribution during vertebrate embryogenesis. Overall, Nano3P-seq is a simple and robust method for accurately estimating transcript levels, tail lengths, and tail composition heterogeneity in individual reads, with minimal library preparation biases, both in the coding and non-coding transcriptome.

ABSTRACT RNA modifications hold pivotal roles in shaping the fate and function of RNA molecules. Although nanopore sequencing technologies have proven successful at transcriptome-wide detection of RNA modifications, current algorithms are limited to predicting modifications at a per-site level rather than within individual RNA molecules. Herein, we introduce m 6 ABasecaller , an innovative method enabling direct basecalling of m 6 A modifications from raw nanopore signals within individual RNA molecules. This approach facilitates de novo prediction of m 6 A modifications with precision down to the single nucleotide and single molecule levels, without the need of paired knockout or control conditions. Using the m 6 ABasecaller , we find that the median transcriptome-wide m 6 A modification stoichiometry is ∼10-15% in human, mouse and zebrafish. Furthermore, we show that m 6 A modifications affect polyA tail lengths, exhibit a propensity for co-occurrence within the same RNA molecules, and show relatively consistent stoichiometry levels across isoforms. We further validate the m 6 ABasecaller by treating mESC with increasing concentrations of STM2457, a METTL3 inhibitor as well as in inducible METTL3 knockout systems. Overall, this work demonstrates the feasibility de novo basecalling of m 6 A modifications, opening novel avenues for the application of nanopore sequencing to samples with limited RNA availability and for which control knockout conditions are unavailable, such as patient-derived samples.

ABSTRACT The existence of naturally occurring ribosome heterogeneity is now a well-acknowledged phenomenon. However, whether this heterogeneity leads to functionally diverse ‘specialized ribosomes’ is still a controversial topic. Here, we explore the biological function of RPL3L (uL3L), a ribosomal protein (RP) paralog of RPL3 (uL3) that is exclusively expressed in muscle and heart tissues, by generating a viable homozygous Rpl3l knockout mouse strain. We identify a rescue mechanism in which, upon RPL3L depletion, RPL3 becomes upregulated, yielding RPL3-containing ribosomes instead of RPL3L-containing ribosomes that are typically found in cardiomyocytes. Using both ribosome profiling (Ribo-Seq) and a novel orthogonal approach consisting of ribosome pulldown coupled to nanopore sequencing (Nano-TRAP), we find that RPL3L neither modulates translational efficiency nor ribosome affinity towards a specific subset of transcripts. By contrast, we show that depletion of RPL3L leads to increased ribosome-mitochondria interactions in cardiomyocytes, which is accompanied by a significant increase in ATP levels, potentially as a result of mitochondrial activity fine-tuning. Our results demonstrate that the existence of tissue-specific RP paralogs does not necessarily lead to enhanced translation of specific transcripts or modulation of translational output. Instead, we reveal a complex cellular scenario in which RPL3L modulates the expression of RPL3, which in turn affects ribosomal subcellular localization and, ultimately, mitochondrial activity.

The biological relevance and dynamics of mRNA modifications have been extensively studied; however, whether rRNA modifications are dynamically regulated, and under which conditions, remains unclear. Here, we systematically characterize bacterial rRNA modifications upon exposure to diverse antibiotics using native RNA nanopore sequencing. To identify significant rRNA modification changes, we develop NanoConsensus, a novel pipeline that is robust across RNA modification types, stoichiometries and coverage, with very low false positive rates, outperforming all individual algorithms tested. We then apply NanoConsensus to characterize the rRNA modification landscape upon antibiotic exposure, finding that rRNA modification profiles are altered in the vicinity of A and P-sites of the ribosome, in an antibiotic-specific manner, possibly contributing to antibiotic resistance. Our work demonstrates that rRNA modification profiles can be rapidly altered in response to environmental exposures, and provides a robust workflow to study rRNA modification dynamics in any species, in a scalable and reproducible manner. It remains unclear whether rRNA modifications can be naturally altered in response to antibiotics in bacteria. Here, the authors analyzed direct RNA nanopore sequencing data with an analytical pipeline Nanoconsensus, to investigate whether bacterial rRNA modifications are modulated upon exposure to various antibiotics.

The genomes of positive-sense (+) single-stranded RNA (ssRNA) viruses are believed to be subjected to a wide range of RNA modifications. In this study, we focused on the chikungunya virus (CHIKV) as a model (+) ssRNA virus to study the landscape of viral RNA modification in infected human cells. Among the 32 distinct RNA modifications analysed by mass spectrometry, inosine was found enriched in the genomic CHIKV RNA. However, orthogonal validation by Illumina RNA-seq analyses did not identify any inosine modification along the CHIKV RNA genome. Moreover, CHIKV infection did not alter the expression of ADAR1 isoforms, the enzymes that catalyse the adenosine to inosine conversion. Together, this study highlights the importance of a multidisciplinary approach to assess the presence of RNA modifications in viral RNA genomes.