Pre-existing neutralizing antibody provides the first line of defence against pathogens in general. For influenza virus, annual vaccinations are given to maintain protective levels of antibody against the currently circulating strains. Here we report that after booster vaccination there was a rapid and robust influenza-specific IgG+ antibody-secreting plasma cell (ASC) response that peaked at approximately day 7 and accounted for up to 6% of peripheral blood B cells. These ASCs could be distinguished from influenza-specific IgG+ memory B cells that peaked 14-21 days after vaccination and averaged 1% of all B cells. Importantly, as much as 80% of ASCs purified at the peak of the response were influenza specific. This ASC response was characterized by a highly restricted B-cell receptor (BCR) repertoire that in some donors was dominated by only a few B-cell clones. This pauci-clonal response, however, showed extensive intraclonal diversification from accumulated somatic mutations. We used the immunoglobulin variable regions isolated from sorted single ASCs to produce over 50 human monoclonal antibodies (mAbs) that bound to the three influenza vaccine strains with high affinity. This strategy demonstrates that we can generate multiple high-affinity mAbs from humans within a month after vaccination. The panel of influenza-virus-specific human mAbs allowed us to address the issue of original antigenic sin (OAS): the phenomenon where the induced antibody shows higher affinity to a previously encountered influenza virus strain compared with the virus strain present in the vaccine. However, we found that most of the influenza-virus-specific mAbs showed the highest affinity for the current vaccine strain. Thus, OAS does not seem to be a common occurrence in normal, healthy adults receiving influenza vaccination.

The 2009 pandemic H1N1 influenza pandemic demonstrated the global health threat of reassortant influenza strains. Herein, we report a detailed analysis of plasmablast and monoclonal antibody responses induced by pandemic H1N1 infection in humans. Unlike antibodies elicited by annual influenza vaccinations, most neutralizing antibodies induced by pandemic H1N1 infection were broadly cross-reactive against epitopes in the hemagglutinin (HA) stalk and head domain of multiple influenza strains. The antibodies were from cells that had undergone extensive affinity maturation. Based on these observations, we postulate that the plasmablasts producing these broadly neutralizing antibodies were predominantly derived from activated memory B cells specific for epitopes conserved in several influenza strains. Consequently, most neutralizing antibodies were broadly reactive against divergent H1N1 and H5N1 influenza strains. This suggests that a pan-influenza vaccine may be possible, given the right immunogen. Antibodies generated potently protected and rescued mice from lethal challenge with pandemic H1N1 or antigenically distinct influenza strains, making them excellent therapeutic candidates.

Significance In this study, we address the issue of cross-reactivity between dengue virus (DENV) and Zika virus (ZIKV) by testing sera and plasmablast-derived monoclonal antibodies from dengue patients against ZIKV. We show that both acute and convalescent dengue sera potently bind and neutralize ZIKV and that this cross-reactivity is also evident at the monoclonal level. We also demonstrate in vitro antibody-dependent enhancement of ZIKV infection in the presence of dengue-induced antibodies. Our findings strongly suggest that preexisting dengue antibodies may modulate immune responses to ZIKV infection. These data are timely and highly relevant from a public health standpoint given that a majority of regions currently experiencing Zika virus epidemics are endemic for dengue.

Class switch recombination (CSR) is a region-specific DNA recombination reaction that replaces one immunoglobulin heavy-chain constant region (Ch) gene with another. This enables a single variable (V) region gene to be used in conjunction with different downstream Ch genes, each having a unique biological activity. The molecular mechanisms that mediate CSR have not been defined, but activation-induced cytidine deaminase (AID), a putative RNA-editing enzyme, is required for this reaction1. Here we report that the Nijmegen breakage syndrome protein (Nbs1) and phosphorylated H2A histone family member X (γ-H2AX, also known as γ-H2afx), which facilitate DNA double-strand break (DSB) repair2,3,4, form nuclear foci at the Ch region in the G1 phase of the cell cycle in cells undergoing CSR, and that switching is impaired in H2AX-/- mice. Localization of Nbs1 and γ-H2AX to the Igh locus during CSR is dependent on AID. In addition, AID is required for induction of switch region (Sµ)-specific DNA lesions that precede CSR. These results place AID function upstream of the DNA modifications that initiate CSR.

Significance The majority of influenza vaccine antigens are prepared in chicken eggs. Human vaccine strains grown in eggs often possess adaptive mutations that increase viral attachment to chicken cells. Most of these adaptive mutations are in the hemagglutinin protein, which functions as a viral attachment factor. Here, we identify a hemagglutinin mutation in the current egg-adapted H3N2 vaccine strain that alters antigenicity. We show that ferrets and humans exposed to the current egg-adapted H3N2 vaccine strain produce antibodies that poorly neutralize H3N2 viruses that circulated during the 2016–2017 influenza season. These studies highlight the challenges associated with producing influenza vaccine antigens in eggs, while offering a potential explanation of why there was only moderate vaccine effectiveness during the 2016–2017 influenza season.

We describe herein a protocol for the production of antigen-specific human monoclonal antibodies (hmAbs). Antibody-secreting cells (ASCs) are isolated from whole blood collected 7 d after vaccination and sorted by flow cytometry into single cell plates. The antibody genes of the ASCs are then amplified by RT-PCR and nested PCR, cloned into expression vectors and transfected into a human cell line. The expressed antibodies can then be purified and assayed for binding and neutralization. This method uses established techniques but is novel in their combination and application. This protocol can be completed with as little as 20 ml of human blood and in as little as 28 d when optimal. Although previous methodologies to produce hmAbs, including B-cell immortalization or phage display, can be used to isolate the rare specific antibody even years after immunization, in comparison, these approaches are inefficient, resulting in few relevant antibodies. Although dependent on having an ongoing immune response, the approach described herein can be used to rapidly generate numerous antigen-specific hmAbs in a short time.

Emerging evidence indicates a central role for the microbiome in immunity. However, causal evidence in humans is sparse. Here, we administered broad-spectrum antibiotics to healthy adults prior and subsequent to seasonal influenza vaccination. Despite a 10,000-fold reduction in gut bacterial load and long-lasting diminution in bacterial diversity, antibody responses were not significantly affected. However, in a second trial of subjects with low pre-existing antibody titers, there was significant impairment in H1N1-specific neutralization and binding IgG1 and IgA responses. In addition, in both studies antibiotics treatment resulted in (1) enhanced inflammatory signatures (including AP-1/NR4A expression), observed previously in the elderly, and increased dendritic cell activation; (2) divergent metabolic trajectories, with a 1,000-fold reduction in serum secondary bile acids, which was highly correlated with AP-1/NR4A signaling and inflammasome activation. Multi-omics integration revealed significant associations between bacterial species and metabolic phenotypes, highlighting a key role for the microbiome in modulating human immunity.

Immunoglobulin A (IgA) is prominently secreted at mucosal surfaces and coats a fraction of the intestinal microbiota. However, the commensal bacteria bound by IgA are poorly characterized and the type of humoral immunity they elicit remains elusive. We used bacterial flow cytometry coupled with 16S rRNA gene sequencing (IgA-Seq) in murine models of immunodeficiency to identify IgA-bound bacteria and elucidate mechanisms of commensal IgA targeting. We found that residence in the small intestine, rather than bacterial identity, dictated induction of specific IgA. Most commensals elicited strong T-independent (TI) responses that originated from the orphan B1b lineage and from B2 cells, but excluded natural antibacterial B1a specificities. Atypical commensals including segmented filamentous bacteria and Mucispirillum evaded TI responses but elicited T-dependent IgA. These data demonstrate exquisite targeting of distinct commensal bacteria by multiple layers of humoral immunity and reveal a specialized function of the B1b lineage in TI mucosal IgA responses.

A new method facilitates high-throughput sequencing of the repertoire of immunoglobulin heavy-light chain pairs in human B cells. Each B-cell receptor consists of a pair of heavy and light chains. High-throughput sequencing can identify large numbers of heavy- and light-chain variable regions (VH and VL) in a given B-cell repertoire, but information about endogenous pairing of heavy and light chains is lost after bulk lysis of B-cell populations. Here we describe a way to retain this pairing information. In our approach, single B cells (>5 × 104 capacity per experiment) are deposited in a high-density microwell plate (125 pl/well) and lysed in situ. mRNA is then captured on magnetic beads, reverse transcribed and amplified by emulsion VH:VL linkage PCR. The linked transcripts are analyzed by Illumina high-throughput sequencing. We validated the fidelity of VH:VL pairs identified by this approach and used the method to sequence the repertoire of three human cell subsets—peripheral blood IgG+ B cells, peripheral plasmablasts isolated after tetanus toxoid immunization and memory B cells isolated after seasonal influenza vaccination.

Most antibodies are highly specific, binding with high affinity to a single foreign antigen. However, an analysis of human immunodeficiency virus (HIV) envelope glycoprotein-specific monoclonal antibodies from infected subjects provides evidence for a surprisingly high degree of polyreactivity. Of 134 different antibodies directed at the gp140 envelope glycoprotein cloned from six patients, 75% were polyreactive, binding with high affinity to one gp140 site and with lower affinity to other sites on the viral surface. Relatively few gp140 glycoprotein spikes are displayed on the surface of HIV, so homotypic bivalent antibody binding is disfavoured and 'heteroligation' may help to improve net antibody affinity in such instances. During immune responses, antibodies are selected for their ability to bind to foreign antigens with high affinity, in part by their ability to undergo homotypic bivalent binding. However, this type of binding is not always possible. Here, the monoclonal antibodies produced in two infected subjects in response to human immunodeficiency virus (HIV) glycoprotein have been analysed. The results provide evidence for polyreactivity, which may be required when the density of glycoprotein spikes is so low that bivalent binding is unlikely. During immune responses, antibodies are selected for their ability to bind to foreign antigens with high affinity, in part by their ability to undergo homotypic bivalent binding. However, this type of binding is not always possible. For example, the small number of gp140 glycoprotein spikes displayed on the surface of the human immunodeficiency virus (HIV) disfavours homotypic bivalent antibody binding1,2,3. Here we show that during the human antibody response to HIV, somatic mutations that increase antibody affinity also increase breadth and neutralizing potency. Surprisingly, the responding naive and memory B cells produce polyreactive antibodies, which are capable of bivalent heteroligation between one high-affinity anti-HIV-gp140 combining site and a second low-affinity site on another molecular structure on HIV. Although cross-reactivity to self-antigens or polyreactivity is strongly selected against during B-cell development4, it is a common serologic feature of certain infections in humans, including HIV, Epstein-Barr virus and hepatitis C virus. Seventy-five per cent of the 134 monoclonal anti-HIV-gp140 antibodies cloned from six patients5 with high titres of neutralizing antibodies are polyreactive. Despite the low affinity of the polyreactive combining site, heteroligation demonstrably increases the apparent affinity of polyreactive antibodies to HIV.