The plant-pathogenic fungus Mycosphaerella graminicola (asexual stage: Septoria tritici) causes septoria tritici blotch, a disease that greatly reduces the yield and quality of wheat. This disease is economically important in most wheat-growing areas worldwide and threatens global food production. Control of the disease has been hampered by a limited understanding of the genetic and biochemical bases of pathogenicity, including mechanisms of infection and of resistance in the host. Unlike most other plant pathogens, M. graminicola has a long latent period during which it evades host defenses. Although this type of stealth pathogenicity occurs commonly in Mycosphaerella and other Dothideomycetes, the largest class of plant-pathogenic fungi, its genetic basis is not known. To address this problem, the genome of M. graminicola was sequenced completely. The finished genome contains 21 chromosomes, eight of which could be lost with no visible effect on the fungus and thus are dispensable. This eight-chromosome dispensome is dynamic in field and progeny isolates, is different from the core genome in gene and repeat content, and appears to have originated by ancient horizontal transfer from an unknown donor. Synteny plots of the M. graminicola chromosomes versus those of the only other sequenced Dothideomycete, Stagonospora nodorum, revealed conservation of gene content but not order or orientation, suggesting a high rate of intra-chromosomal rearrangement in one or both species. This observed "mesosynteny" is very different from synteny seen between other organisms. A surprising feature of the M. graminicola genome compared to other sequenced plant pathogens was that it contained very few genes for enzymes that break down plant cell walls, which was more similar to endophytes than to pathogens. The stealth pathogenesis of M. graminicola probably involves degradation of proteins rather than carbohydrates to evade host defenses during the biotrophic stage of infection and may have evolved from endophytic ancestors.

Abstract Secreted effector proteins enable plant pathogenic fungi to manipulate host defenses for successful infection. Mycosphaerella graminicola causes Septoria tritici blotch disease of wheat (Triticum aestivum) leaves. Leaf infection involves a long (approximately 7 d) period of symptomless intercellular colonization prior to the appearance of necrotic disease lesions. Therefore, M. graminicola is considered as a hemibiotrophic (or necrotrophic) pathogen. Here, we describe the molecular and functional characterization of M. graminicola homologs of Ecp6 (for extracellular protein 6), the Lysin (LysM) domain-containing effector from the biotrophic tomato (Solanum lycopersicum) leaf mold fungus Cladosporium fulvum, which interferes with chitin-triggered immunity in plants. Three LysM effector homologs are present in the M. graminicola genome, referred to as Mg3LysM, Mg1LysM, and MgxLysM. Mg3LysM and Mg1LysM genes were strongly transcriptionally up-regulated specifically during symptomless leaf infection. Both proteins bind chitin; however, only Mg3LysM blocked the elicitation of chitin-induced plant defenses. In contrast to C. fulvum Ecp6, both Mg1LysM and Mg3LysM also protected fungal hyphae against plant-derived hydrolytic enzymes, and both genes show significantly more nucleotide polymorphism giving rise to nonsynonymous amino acid changes. While Mg1LysM deletion mutant strains of M. graminicola were fully pathogenic toward wheat leaves, Mg3LysM mutant strains were severely impaired in leaf colonization, did not trigger lesion formation, and were unable to undergo asexual sporulation. This virulence defect correlated with more rapid and pronounced expression of wheat defense genes during the symptomless phase of leaf colonization. These data highlight different functions for MgLysM effector homologs during plant infection, including novel activities that distinguish these proteins from C. fulvum Ecp6.

Abstract The hemibiotrophic fungus Zymoseptoria tritici causes Septoria tritici blotch disease of wheat (Triticum aestivum). Pathogen reproduction on wheat occurs without cell penetration, suggesting that dynamic and intimate intercellular communication occurs between fungus and plant throughout the disease cycle. We used deep RNA sequencing and metabolomics to investigate the physiology of plant and pathogen throughout an asexual reproductive cycle of Z. tritici on wheat leaves. Over 3,000 pathogen genes, more than 7,000 wheat genes, and more than 300 metabolites were differentially regulated. Intriguingly, individual fungal chromosomes contributed unequally to the overall gene expression changes. Early transcriptional down-regulation of putative host defense genes was detected in inoculated leaves. There was little evidence for fungal nutrient acquisition from the plant throughout symptomless colonization by Z. tritici, which may instead be utilizing lipid and fatty acid stores for growth. However, the fungus then subsequently manipulated specific plant carbohydrates, including fructan metabolites, during the switch to necrotrophic growth and reproduction. This switch coincided with increased expression of jasmonic acid biosynthesis genes and large-scale activation of other plant defense responses. Fungal genes encoding putative secondary metabolite clusters and secreted effector proteins were identified with distinct infection phase-specific expression patterns, although functional analysis suggested that many have overlapping/redundant functions in virulence. The pathogenic lifestyle of Z. tritici on wheat revealed through this study, involving initial defense suppression by a slow-growing extracellular and nutritionally limited pathogen followed by defense (hyper) activation during reproduction, reveals a subtle modification of the conceptual definition of hemibiotrophic plant infection.

Abstract Zymoseptoria tritici is the most economically significant fungal pathogen of wheat in Europe. However, despite the importance of this pathogen, the molecular interactions between pathogen and host during infection are not well understood. Herein, we describe the use of two libraries of cloned Z. tritici effectors that were screened to identify effector candidates with putative pathogen associated molecular pattern (PAMP) triggered immunity (PTI)-suppressing activity. The effectors from each library were transiently expressed in Nicotiana benthamiana , and expressing leaves were treated with bacterial or fungal PAMPs to assess the effectors’ ability to suppress reactive oxygen species (ROS) production. From these screens, numerous effectors were identified with PTI-suppressing activity. In addition, some effectors were able to suppress cell death responses induced by other Z. tritici secreted proteins. We used structural prediction tools to predict the putative structures of all of the Z. tritici effectors, and used these predictions to examine whether there was enrichment of specific structural signatures among the PTI-suppressing effectors. From among the libraries, multiple members of the killer protein-like 4 (KP4) and killer protein-like 6 (KP6) effector families were identified as PTI-suppressors. This observation is intriguing, as these protein families were previously associated with antimicrobial activity rather than virulence or host manipulation. This data provides mechanistic insight into immune suppression by Z. tritici during infection, and suggests that similar to biotrophic pathogens, this fungus relies on a battery of secreted effectors to suppress host immunity during early phases of colonisation.

SUMMARY Chitin is a major structural component of fungal cell walls and acts as a microbe-associated molecular pattern (MAMP) that, upon recognition by a plant host, triggers the activation of immune responses. In order to avoid the activation of these responses, the Septoria tritici blotch (STB) pathogen of wheat, Zymoseptoria tritici , secretes LysM effector proteins. Previously, the LysM effectors Mg1LysM and Mg3LysM were shown to protect fungal hyphae against host chitinases. Furthermore, Mg3LysM, but not Mg1LysM, was shown to suppress chitin-induced reactive oxygen species (ROS) production. Whereas initially a third LysM effector gene was disregarded as a presumed pseudogene, we now provide functional data to show that also this gene encodes a LysM effector, named Mgx1LysM, that is functional during wheat colonization. While Mg3LysM confers a major contribution to Z. tritici virulence, Mgx1LysM and Mg1LysM contribute to Z. tritici virulence with smaller effects. All three LysM effectors display partial functional redundancy. We furthermore demonstrate that Mgx1LysM binds chitin, suppresses the chitin-induced ROS burst and is able to protect fungal hyphae against chitinase hydrolysis. Finally, we demonstrate that Mgx1LysM is able to undergo chitin-induced polymerisation. Collectively, our data show that Zymoseptoria tritici utilizes three LysM effectors to disarm chitin-triggered wheat immunity.

SUMMARY Septoria tritici blotch (STB), caused by the fungus Zymoseptoria tritici , is one of the most economically important diseases of wheat. Recently, both factors of a gene-for-gene interaction between Z. tritici and wheat, the wheat receptor-like kinase Stb6 and the Z. tritici secreted effector protein AvrStb6, have been identified. Previous analyses revealed a high diversity of AvrStb6 alleles present in historic Z. tritici isolate collections, with up to ~ 18% of analysed isolates possessing the avirulence isoform of AvrStb6 identical to that originally identified in the reference isolate IPO323. With Stb6 present in many commercial wheat cultivars globally, we aimed to assess potential changes in AvrStb6 genetic diversity and the incidence of alleles allowing evasion of Stb6 -mediated resistance in more recent Z. tritici populations. Here we show, using targeted re-sequencing of AvrStb6, that this gene is universally present in field isolates sampled from major wheat-growing regions of the world between 2013–2017. However, in contrast to the data from studies of historic isolates, our study revealed a complete absence of the originally described avirulence isoform of AvrStb6 amongst modern Z. tritici isolates. Moreover, a remarkably small number of alleles, each encoding AvrStb6 protein isoforms conditioning virulence on Stb6- containing wheat, were found to predominate among modern Z. tritici isolates. A single virulence isoform of AvrStb6 was found to be particularly abundant throughout the global population. These findings indicate that, despite the ability of Z. tritici to sexually reproduce on resistant hosts, AvrStb6 avirulence alleles tend to be eliminated in subsequent populations.

SUMMARY Heterochromatin is characterized by specific histone post-translational modifications such as the di- and tri-methylation of histone H3 on lysine 9 (H3K9me2/3), which direct the recruitment of ‘reader’ proteins to chromatin. In the fungal phytopathogen, Zymoseptoria tritici, deletion of the H3K9 methyltransferase gene kmt1, results in a global increase in the expression of transposable elements (TEs), genome instability and loss of virulence. Here we have identified two Z. tritici chromodomain proteins, Cbx1 and Cbx2, that recognise H3K9me modifications. Cbx1 is a Heterochromatin Protein 1 homolog that binds H3K9me2/3 in vitro and associates with heterochromatic loci in vivo . Transcriptomic analysis also indicates that Cbx1 and Kmt1 regulate overlapping sets of protein-encoding genes. However, unlike Δ kmt1 mutants, Δ cbx1 strains do not exhibit a global increase in TE expression and have only a partial reduction in virulence, suggesting the existence of additional H3K9me reader proteins. Accordingly, we have identified a fungal-specific chromodomain protein, Cbx2, that binds H3K9me3 in vitro . Strikingly, the growth defects of Δ cbx1 Δ cbx2 double mutants closely resemble those of Δ kmt1 consistent with Cbx1 and Cbx2 playing redundant roles in gene silencing. Overall, the data suggest that key functions of H3K9me modifications are mediated by a combination of Cbx1 and Cbx2.

Filamentous plant pathogenic fungi pose significant threats to global food security, particularly through diseases like Fusarium Head Blight (FHB) and Septoria Tritici Blotch (STB) which affects cereals. With mounting challenges in fungal control and increasing restrictions on fungicide use due to environmental concerns, there is an urgent need for innovative control strategies. Here, we present a comprehensive analysis of the stage-specific infection process of Fusarium graminearum in wheat spikes by generating a dual weighted gene co-expression network (WGCN). Notably, the network contained a mycotoxin-enriched fungal module (F12) that exhibited a significant correlation with a detoxification gene-enriched wheat module (W12). This correlation in gene expression was validated through quantitative PCR. By examining a fungal module with genes highly expressed during early symptomless infection that was correlated to a wheat module enriched in oxidative stress genes, we identified a gene encoding FgKnr4, a protein containing a Knr4/Smi1 disordered domain. Through comprehensive analysis, we confirmed the pivotal role of FgKnr4 in various biological processes, including oxidative stress tolerance, cell cycle stress tolerance, morphogenesis, growth, and pathogenicity. Further studies confirmed the observed phenotypes are partially due to the involvement of FgKnr4 in regulating the fungal cell wall integrity pathway by modulating the phosphorylation of the MAP-kinase MGV1. Orthologues of the FgKnr4 gene are widespread across the fungal kingdom but are absent in other Eukaryotes, suggesting the protein has potential as a promising intervention target. Encouragingly, the restricted growth and highly reduced virulence phenotypes observed for ΔFgknr4 were replicated upon deletion of the orthologous gene in the wheat fungal pathogen Zymoseptoria tritici . Overall, this study demonstrates the utility of an integrated network-level analytical approach to pinpoint genes of high interest to pathogenesis and disease control.

Cross-kingdom small RNA (sRNA) silencing has recently emerged as a mechanism facilitating fungal colonization and disease development. Here we characterized RNAi pathways in Zymoseptoria tritici, a major fungal pathogen of wheat, and assessed their contribution to pathogenesis. Computational analysis of fungal sRNA and host mRNA sequencing datasets was used to define the global sRNA populations in Z. tritici and predict their mRNA targets in wheat. 389 in planta-induced sRNA loci were identified. sRNAs generated from some of these loci were predicted to target wheat mRNAs including those potentially involved in pathogen defense. However, molecular approaches failed to validate targeting of selected wheat mRNAs by fungal sRNAs. Mutant strains of Z. tritici carrying deletions of genes encoding key components of RNAi such as Dicer-like (DCL) and Argounate (AGO) proteins were generated, and virulence bioassays suggested that these are dispensable for full infection of wheat. Nonetheless, our results did suggest the existence of non-canonical DCL-independent pathway(s) for sRNA biogenesis in Z. tritici. dsRNA targeting essential fungal genes applied in vitro or generated from an RNA virus vector in planta in a procedure known as HIGS (Host-Induced Gene Silencing) was ineffective in preventing Z. tritici growth or disease. We also demonstrated that Z. tritici is incapable of dsRNA uptake. Collectively, our data suggest that RNAi approaches for gene function analyses in this fungal species and potentially also as a control measure may not be as effective as has been demonstrated for some other plant pathogenic fungi.

Abstract Despite large omics datasets, the establishment of a reliable gene annotation is still challenging for eukaryotic genomes. Here, we used the reference genome of the major fungal wheat pathogen Zymoseptoria tritici (isolate IPO323) as a case study to develop methods to improve eukaryotic gene prediction. Four previous IPO323 annotations identified 10,933 to 13,260 gene models, but only one third of these coding sequences (CDS) have identical structures. To resolve these discrepancies and improve gene models, we generated full-length transcripts using long-read sequencing. This dataset was used together with other evidence (RNA-Seq transcripts and protein sequences) to generate novel ab initio gene models. The selection of the best structure among novel and existing gene models was performed according to transcript and protein evidence using InGenAnnot, a novel bioinformatics suite. Overall, 13,414 re-annotated gene models (RGMs) were predicted, including 671 new genes among which 53 encoded effector candidates. This process corrected many of the errors (15%) observed in previous gene models (coding sequence fusions, false introns, missing exons). While fungal genomes have poor annotations of untranslated regions (UTRs), our Iso-Seq long-read sequences outlined 5’ and 3’UTRs for 73% of the RGMs. Alternative transcripts were identified for 13% of RGMs, mostly due to intron retention (75%), likely corresponding to unprocessed pre-mRNAs. A total of 353 genes displayed alternative transcripts with combinations of previously predicted or novel exons. Long non-coding transcripts (lncRNAs) and double-stranded RNAs from two fungal viruses were also identified. Most lncRNAs corresponded to antisense transcripts of genes (52%). lncRNAs that were up or down regulated during infection were enriched in antisense transcripts (70%), suggesting their involvement in the control of gene expression. Our results showed that combining different ab initio gene predictions and evidence-driven curation using InGenAnnot improved the quality of gene annotations of a compact eukaryotic genome. Our analysis also provided new insights into the transcriptional landscape of Z. tritici , helping develop an increasingly complex picture of its biology.