Targeted gene regulation on a genome-wide scale is a powerful strategy for interrogating, perturbing, and engineering cellular systems. Here, we develop a method for controlling gene expression based on Cas9, an RNA-guided DNA endonuclease from a type II CRISPR system. We show that a catalytically dead Cas9 lacking endonuclease activity, when coexpressed with a guide RNA, generates a DNA recognition complex that can specifically interfere with transcriptional elongation, RNA polymerase binding, or transcription factor binding. This system, which we call CRISPR interference (CRISPRi), can efficiently repress expression of targeted genes in Escherichia coli, with no detectable off-target effects. CRISPRi can be used to repress multiple target genes simultaneously, and its effects are reversible. We also show evidence that the system can be adapted for gene repression in mammalian cells. This RNA-guided DNA recognition platform provides a simple approach for selectively perturbing gene expression on a genome-wide scale.

The genetic interrogation and reprogramming of cells requires methods for robust and precise targeting of genes for expression or repression. The CRISPR-associated catalytically inactive dCas9 protein offers a general platform for RNA-guided DNA targeting. Here, we show that fusion of dCas9 to effector domains with distinct regulatory functions enables stable and efficient transcriptional repression or activation in human and yeast cells, with the site of delivery determined solely by a coexpressed short guide (sg)RNA. Coupling of dCas9 to a transcriptional repressor domain can robustly silence expression of multiple endogenous genes. RNA-seq analysis indicates that CRISPR interference (CRISPRi)-mediated transcriptional repression is highly specific. Our results establish that the CRISPR system can be used as a modular and flexible DNA-binding platform for the recruitment of proteins to a target DNA sequence, revealing the potential of CRISPRi as a general tool for the precise regulation of gene expression in eukaryotic cells.

While the catalog of mammalian transcripts and their expression levels in different cell types and disease states is rapidly expanding, our understanding of transcript function lags behind. We present a robust technology enabling systematic investigation of the cellular consequences of repressing or inducing individual transcripts. We identify rules for specific targeting of transcriptional repressors (CRISPRi), typically achieving 90%-99% knockdown with minimal off-target effects, and activators (CRISPRa) to endogenous genes via endonuclease-deficient Cas9. Together they enable modulation of gene expression over a ∼1,000-fold range. Using these rules, we construct genome-scale CRISPRi and CRISPRa libraries, each of which we validate with two pooled screens. Growth-based screens identify essential genes, tumor suppressors, and regulators of differentiation. Screens for sensitivity to a cholera-diphtheria toxin provide broad insights into the mechanisms of pathogen entry, retrotranslocation and toxicity. Our results establish CRISPRi and CRISPRa as powerful tools that provide rich and complementary information for mapping complex pathways.

The spatiotemporal organization and dynamics of chromatin play critical roles in regulating genome function. However, visualizing specific, endogenous genomic loci remains challenging in living cells. Here, we demonstrate such an imaging technique by repurposing the bacterial CRISPR/Cas system. Using an EGFP-tagged endonuclease-deficient Cas9 protein and a structurally optimized small guide (sg) RNA, we show robust imaging of repetitive elements in telomeres and coding genes in living cells. Furthermore, an array of sgRNAs tiling along the target locus enables the visualization of nonrepetitive genomic sequences. Using this method, we have studied telomere dynamics during elongation or disruption, the subnuclear localization of the MUC4 loci, the cohesion of replicated MUC4 loci on sister chromatids, and their dynamic behaviors during mitosis. This CRISPR imaging tool has potential to significantly improve the capacity to study the conformation and dynamics of native chromosomes in living human cells.

Signals in many biological processes can be amplified by recruiting multiple copies of regulatory proteins to a site of action. Harnessing this principle, we have developed a protein scaffold, a repeating peptide array termed SunTag, which can recruit multiple copies of an antibody-fusion protein. We show that the SunTag can recruit up to 24 copies of GFP, thereby enabling long-term imaging of single protein molecules in living cells. We also use the SunTag to create a potent synthetic transcription factor by recruiting multiple copies of a transcriptional activation domain to a nuclease-deficient CRISPR/Cas9 protein and demonstrate strong activation of endogenous gene expression and re-engineered cell behavior with this system. Thus, the SunTag provides a versatile platform for multimerizing proteins on a target protein scaffold and is likely to have many applications in imaging and controlling biological outputs.

Sequence-specific control of gene expression on a genome-wide scale is an important approach for understanding gene functions and for engineering genetic regulatory systems. We have recently described an RNA-based method, CRISPR interference (CRISPRi), for targeted silencing of transcription in bacteria and human cells. The CRISPRi system is derived from the Streptococcus pyogenes CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats) pathway, requiring only the coexpression of a catalytically inactive Cas9 protein and a customizable single guide RNA (sgRNA). The Cas9-sgRNA complex binds to DNA elements complementary to the sgRNA and causes a steric block that halts transcript elongation by RNA polymerase, resulting in the repression of the target gene. Here we provide a protocol for the design, construction and expression of customized sgRNAs for transcriptional repression of any gene of interest. We also provide details for testing the repression activity of CRISPRi using quantitative fluorescence assays and native elongating transcript sequencing. CRISPRi provides a simplified approach for rapid gene repression within 1–2 weeks. The method can also be adapted for high-throughput interrogation of genome-wide gene functions and genetic interactions, thus providing a complementary approach to RNA interference, which can be used in a wider variety of organisms.

Eukaryotic cells execute complex transcriptional programs in which specific loci throughout the genome are regulated in distinct ways by targeted regulatory assemblies. We have applied this principle to generate synthetic CRISPR-based transcriptional programs in yeast and human cells. By extending guide RNAs to include effector protein recruitment sites, we construct modular scaffold RNAs that encode both target locus and regulatory action. Sets of scaffold RNAs can be used to generate synthetic multigene transcriptional programs in which some genes are activated and others are repressed. We apply this approach to flexibly redirect flux through a complex branched metabolic pathway in yeast. Moreover, these programs can be executed by inducing expression of the dCas9 protein, which acts as a single master regulatory control point. CRISPR-associated RNA scaffolds provide a powerful way to construct synthetic gene expression programs for a wide range of applications, including rewiring cell fates or engineering metabolic pathways.

Essential gene functions underpin the core reactions required for cell viability, but their contributions and relationships are poorly studied in vivo. Using CRISPR interference, we created knockdowns of every essential gene in Bacillus subtilis and probed their phenotypes. Our high-confidence essential gene network, established using chemical genomics, showed extensive interconnections among distantly related processes and identified modes of action for uncharacterized antibiotics. Importantly, mild knockdown of essential gene functions significantly reduced stationary-phase survival without affecting maximal growth rate, suggesting that essential protein levels are set to maximize outgrowth from stationary phase. Finally, high-throughput microscopy indicated that cell morphology is relatively insensitive to mild knockdown but profoundly affected by depletion of gene function, revealing intimate connections between cell growth and shape. Our results provide a framework for systematic investigation of essential gene functions in vivo broadly applicable to diverse microorganisms and amenable to comparative analysis.

Developing technologies for efficient and scalable disruption of gene expression will provide powerful tools for studying gene function, developmental pathways, and disease mechanisms. Here, we develop clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference (CRISPRi) to repress gene expression in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). CRISPRi, in which a doxycycline-inducible deactivated Cas9 is fused to a KRAB repression domain, can specifically and reversibly inhibit gene expression in iPSCs and iPSC-derived cardiac progenitors, cardiomyocytes, and T lymphocytes. This gene repression system is tunable and has the potential to silence single alleles. Compared with CRISPR nuclease (CRISPRn), CRISPRi gene repression is more efficient and homogenous across cell populations. The CRISPRi system in iPSCs provides a powerful platform to perform genome-scale screens in a wide range of iPSC-derived cell types, dissect developmental pathways, and model disease.

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic, caused by the SARS-CoV-2 virus, has highlighted the need for antiviral approaches that can target emerging viruses with no effective vaccines or pharmaceuticals. Here, we demonstrate a CRISPR-Cas13-based strategy, PAC-MAN (prophylactic antiviral CRISPR in human cells), for viral inhibition that can effectively degrade RNA from SARS-CoV-2 sequences and live influenza A virus (IAV) in human lung epithelial cells. We designed and screened CRISPR RNAs (crRNAs) targeting conserved viral regions and identified functional crRNAs targeting SARS-CoV-2. This approach effectively reduced H1N1 IAV load in respiratory epithelial cells. Our bioinformatic analysis showed that a group of only six crRNAs can target more than 90% of all coronaviruses. With the development of a safe and effective system for respiratory tract delivery, PAC-MAN has the potential to become an important pan-coronavirus inhibition strategy.