Centrosomes are non-membrane-bound compartments that nucleate microtubule arrays. They consist of nanometer-scale centrioles surrounded by a micron-scale, dynamic assembly of protein called the pericentriolar material (PCM). To study how PCM forms a spherical compartment that nucleates microtubules, we reconstituted PCM-dependent microtubule nucleation in vitro using recombinant C. elegans proteins. We found that macromolecular crowding drives assembly of the key PCM scaffold protein SPD-5 into spherical condensates that morphologically and dynamically resemble in vivo PCM. These SPD-5 condensates recruited the microtubule polymerase ZYG-9 (XMAP215 homolog) and the microtubule-stabilizing protein TPXL-1 (TPX2 homolog). Together, these three proteins concentrated tubulin ∼4-fold over background, which was sufficient to reconstitute nucleation of microtubule asters in vitro. Our results suggest that in vivo PCM is a selective phase that organizes microtubule arrays through localized concentration of tubulin by microtubule effector proteins.

The formation of membrane-less organelles and compartments by protein phase separation is an important way in which cells organize their cytoplasm and nucleoplasm. In vitro phase separation assays with purified proteins have become the standard way to investigate proteins that form membrane-less compartments. By now, various proteins have been purified and tested for their ability to phase separate and form liquid condensates in vitro. However, phase-separating proteins are often aggregation-prone and difficult to purify and handle. As a consequence, the results from phase separation assays often differ between labs and are not easily reproduced. Thus, there is an urgent need for high-quality proteins, standardized procedures, and generally agreed-upon practices for protein purification and conducting phase separation assays. This paper provides protocols for protein purification and guides the user through the practicalities of in vitro protein phase separation assays, including best-practice approaches and pitfalls to avoid. We believe that this compendium of protocols and practices will provide a useful resource for scientists studying the phase behavior of proteins.

A little bit of this and a little bit of that Centrosomes are the major microtubule-organizing centers in animal cells. Key to this function is the somewhat mysterious pericentriolar material (PCM). Woodruff et al. describe the in vitro reconstitution of PCM assembly. In cells, PCM is recruited by centrioles to form centrosomes that nucleate and anchor microtubules. SPD-5, the main component of the PCM matrix in Caenorhabiditis elegans , polymerized in vitro to form micrometer-sized porous networks. SPD-5 polymerization was directly controlled by the polo family kinase Plk1 and Cep192/SPD-2, two conserved regulators that control PCM assembly across metazoans. Science , this issue p. 808

Abstract The tubby family protein–TULP3 coordinates with the intraflagellar transport complex-A (IFT-A) in trafficking certain transmembrane proteins to cilia. These transmembrane cargoes have short motifs that are necessary and sufficient for TULP3-mediated trafficking. However, whether TULP3 regulates trafficking of membrane-associated proteins is not well understood. Here we show that TULP3 is required for transport of the atypical GTPase ARL13B into cilia, and for ciliary enrichment of ARL13B-dependent farnesylated and myristoylated proteins. ARL13B transport requires TULP3 binding to IFT-A core but not to phosphoinositides, unlike transmembrane cargo transport that requires binding to both by TULP3. A conserved lysine in TULP3’s tubby domain mediates direct ARL13B binding and trafficking of lipidated and transmembrane cargoes. An N-terminal amphipathic helix in ARL13B flanking the palmitoylation site mediates binding to TULP3 and directs trafficking to cilia even in absence of palmitoylation and RVxP sorting motif. Therefore, TULP3 transports transmembrane proteins and ARL13B into cilia by capture of short sequences through a shared tubby domain site.

During mitosis, the centrosome expands its capacity to nucleate microtubules. Understanding the mechanisms of centrosomal microtubule nucleation is, however, constrained by a lack of knowledge of the amount of soluble and polymer tubulin at mitotic centrosomes. Here we combined light microscopy and serial-section electron tomography to measure the amount of dimer and polymer at mitotic centrosomes in early C. elegans embryos. We show that a C. elegans one-cell stage centrosome at metaphase contains more than ten thousand microtubules with a total polymer concentration of 230 μM. Centrosomes concentrate soluble α/β tubulin by about tenfold over the cytoplasm, reaching peak values of 470 μM, giving a combined total monomer and polymer tubulin concentration at centrosomes of up to 660 μM. These findings support in vitro data suggesting that microtubule nucleation in C. elegans centrosomes is driven in part by concentrating soluble tubulin.

Centrosomes organize microtubules that are essential for mitotic divisions in animal cells. They consist of centrioles surrounded by Pericentriolar Material (PCM). Questions related to mechanisms of centriole assembly, PCM organization, and microtubule formation remain unanswered, in part due to limited availability of molecular-resolution structural analyses

Centrosomes must resist microtubule-mediated forces for mitotic chromosome segregation. During mitotic exit, however, centrosomes are deformed and fractured by those same forces, which is a key step in centrosome disassembly. How the functional material properties of centrosomes change throughout the cell cycle, and how they are molecularly tuned remain unknown. Here, we used optically-induced flow perturbations to determine the molecular basis of centrosome strength and ductility in C. elegans embryos. We found that both properties declined sharply at anaphase onset, long before natural disassembly. This mechanical transition required PP2A phosphatase and correlated with inactivation of PLK-1 (Polo Kinase) and SPD-2 (Cep192). In vitro, PLK-1 and SPD-2 directly protected centrosome scaffolds from force-induced disassembly. Our results suggest that, prior to anaphase, PLK-1 and SPD-2 confer strength and ductility to the centrosome scaffold so that it can resist microtubule-pulling forces. In anaphase, centrosomes lose PLK-1 and SPD-2 and transition to a weak, brittle state that enables force-mediated centrosome disassembly.

Centrosomes nucleate microtubule asters and comprise centrioles surrounded by pericentriolar material (PCM). In preparation for mitosis, the PCM scaffold grows dramatically while resisting microtubule pulling forces. How PCM achieves dynamic growth while maintaining mechanical strength is unclear. Here we probed the dynamic and material properties of the C. elegans PCM scaffold. Single-embryo extrusion experiments revealed that the protein SPD-5 forms distinct but co-existing dynamic and stable scaffolds within PCM. The stable scaffold grew in preparation for mitosis, then disappeared at anaphase onset. SPD-5 mutants that lacked PLK-1 phosphorylation at four key sites (4A) could not build the stable scaffold, whereas phospho-mimetic SPD-5(4E) could. Expression of SPD-5(4A) impaired PCM assembly, but this phenotype was partially rescued by eliminating microtubule pulling forces, indicating material weakness. SPD-5(4A) expression also resulted in chromosome segregation defects, revealing the importance of PCM strength for development. Unexpectedly, expression of SPD-5(4E) prevented full-scale PCM growth and caused embryonic lethality. In vitro, PLK-1-induced phosphorylation increased the viscoelastic moduli of minimal SPD-5 scaffolds, which increased their solidity. This caused faster initial growth that then plateaued, in effect setting an upper limit to SPD-5 scaffold size. Thus, PCM scaffold assembly and strength are optimized through phospho-regulated equilibrium of dynamic and stable scaffold components. Our results further reveal kinase-driven kinetic arrest as a potential mechanism of centrosome size scaling.

Abstract Rapidly proliferating cells produce more ribosomes to translate sufficient proteins for cell growth. One of the first and rate limiting steps in translation initiation is the interaction of the small ribosomal subunit with mRNAs. Therefore, effective small ribosomal subunit biogenesis is critical for translation initiation efficiency. Here we report the identification of the zinc finger protein 692 (ZNF692), a MYC-induced nucleolar scaffold that coordinates the final steps in the biogenesis of the small 40S ribosome. ZNF692 forms a complex with rRNA, the 90S processome and the nucleolar exosome in the granular component of the nucleolus creating a hub specialized in the final steps of 18S processing and small ribosomal subunit maturation. Cancer cells are more reliant on ZNF692 for increased translation than normal cells. We propose that MYC increases translation efficiency by promoting the expression of ZNF692, adjusting the translation rate to the increase in mRNA transcription induced by MYC.

Centrosomes are non-membrane-bound compartments that nucleate microtubule arrays. They consist of nanometer-scale centrioles surrounded by a micron-scale, dynamic assembly of protein called the pericentriolar material (PCM). To study how PCM forms a spherical compartment that nucleates microtubules, we reconstituted PCM-dependent microtubule nucleation in vitro using recombinant C. elegans proteins. We found that macromolecular crowding drives phase separation of the key PCM scaffold protein SPD-5 into spherical droplets that morphologically and dynamically resemble in vivo PCM. These SPD-5 droplets recruited the microtubule polymerase ZYG-9 (XMAP215 homologue) and the microtubule-stabilizing protein TPXL-1 (TPX2 homologue). Together, these three proteins concentrated tubulin ~4-fold over background, which was sufficient to reconstitute nucleation of microtubule asters in vitro. Our results suggest that in vivo PCM is a selective phase that organizes microtubule arrays through localized concentration of tubulin by microtubule effector proteins.