Abstract Much attention has focused on LRRK2, as autosomal dominant missense mutations that enhance its kinase activity cause inherited Parkinson’s disease. LRRK2 regulates biology by phosphorylating a subset of Rab GTPases including Rab8A and Rab10 within its effector binding motif. In this study we explore whether LRRK1, a less studied homologue of LRRK2 that regulates growth factor receptor trafficking and osteoclast biology might also phosphorylate Rab proteins. Using mass spectrometry, we found that the endogenous Rab7A protein, phosphorylated at Ser72 was most impacted by LRRK1 knock-out. This residue is not phosphorylated by LRRK2 but lies at the equivalent site targeted by LRRK2 on Rab8A and Rab10. Accordingly, recombinant LRRK1 efficiently phosphorylated Rab7A at Ser72, but not Rab8A or Rab10. Employing a novel phospho-specific antibody, we found that phorbol ester stimulation of mouse embryonic fibroblasts markedly enhanced phosphorylation of Rab7A at Ser72 via LRRK1. We identify two LRRK1 mutations (K746G and I1412T), equivalent to the LRRK2 R1441G and I2020T Parkinson’s mutations, that enhance LRRK1 mediated phosphorylation of Rab7A. We demonstrate that two regulators of LRRK2 namely Rab29 and VPS35[D620N], do not influence LRRK1. Widely used LRRK2 inhibitors do not inhibit LRRK1, but we identify a promiscuous Type-2 tyrosine kinase inhibitor termed GZD-824 that inhibits both LRRK1 and LRRK2. Finally, we show that interaction of Rab7A with its effector RILP is not affected by high stoichiometry LRRK1 phosphorylation. Altogether, these finding reinforce the idea that the LRRK enzymes have evolved as major regulators of Rab biology.

Abstract Rab8a GTPase is associated with the dynamic regulation of membrane protrusions in polarized cells. Rab8a is one of several Rab-family GTPases that are substrates of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), a serine/threonine kinase that is linked to inherited Parkinson’s disease. Rab8a is phosphorylated at T72 (pT72) in its switch 2 helix and the post-translational modification facilitates phospho-Rab8a (pRab8a) interactions with RILPL2, which subsequently regulates ciliogenesis. Here we report the crystal structure of pRab8a in complex with the phospho-Rab binding domain of RILPL2. The complex is a heterotetramer with RILPL2 forming a central α-helical dimer that bridges two pRab8a molecules. The N-termini of the α-helices cross over to form an X-shaped cap (X-cap) that enables electrostatic interactions between Arg residues from RILPL2 and the phosphate moiety from pT72. RILPL2 residues in the X-cap that are critical for pRab8a binding are conserved in the RILP family of effector proteins. We find that JIP3 and JIP4 also interact specifically with LRRK2-phosphorylated Rab10, suggesting a general mode of recognition for phosphorylated Rab GTPases by phospho-specific effectors.

The Parkinsons VPS35[D620N] mutation causes lysosome dysfunction enhancing LRRK2 kinase activity. We find the VPS35[D620N] mutation alters expression of about 350 lysosomal proteins and stimulates LRRK2 recruitment and phosphorylation of Rab proteins at the lysosome. This recruits the phosphoRab effector protein RILPL1 to the lysosome where it binds to the lysosomal integral membrane protein TMEM55B. We identify highly conserved regions of RILPL1 and TMEM55B that interact and design mutations that block binding. In mouse fibroblasts, brain, and lung, we demonstrate that the VPS35 [D620N] mutation reduces RILPL1 levels, in a manner reversed by LRRK2 inhibition. Knock-out of RILPL1 enhances phosphorylation of Rab substrates and knock-out of TMEM55B increases RILPL1 levels. The lysosomotropic agent, LLOMe also induced LRRK2 kinase mediated association of RILPL1 to the lysosome, but to a lower extent than the D620N mutation. Our study uncovers a pathway through which dysfunctional lysosomes resulting from the VPS35[D620N] mutation recruit and activate LRRK2 on the lysosomal surface, driving assembly of the RILPL1-TMEM55B complex.