Drosophila melanogaster is emerging as an important model of non-pathogenic host–microbe interactions. The genetic and experimental tractability of Drosophila has led to significant gains in our understanding of animal–microbial symbiosis. However, the full implications of these results cannot be appreciated without the knowledge of the microbial communities associated with natural Drosophila populations. In particular, it is not clear whether laboratory cultures can serve as an accurate model of host–microbe interactions that occur in the wild, or those that have occurred over evolutionary time. To fill this gap, we characterized natural bacterial communities associated with 14 species of Drosophila and related genera collected from distant geographic locations. To represent the ecological diversity of Drosophilids, examined species included fruit-, flower-, mushroom-, and cactus-feeders. In parallel, wild host populations were compared to laboratory strains, and controlled experiments were performed to assess the importance of host species and diet in shaping bacterial microbiome composition. We find that Drosophilid flies have taxonomically restricted bacterial communities, with 85% of the natural bacterial microbiome composed of only four bacterial families. The dominant bacterial taxa are widespread and found in many different host species despite the taxonomic, ecological, and geographic diversity of their hosts. Both natural surveys and laboratory experiments indicate that host diet plays a major role in shaping the Drosophila bacterial microbiome. Despite this, the internal bacterial microbiome represents only a highly reduced subset of the external bacterial communities, suggesting that the host exercises some level of control over the bacteria that inhabit its digestive tract. Finally, we show that laboratory strains provide only a limited model of natural host–microbe interactions. Bacterial taxa used in experimental studies are rare or absent in wild Drosophila populations, while the most abundant associates of natural Drosophila populations are rare in the lab.

“Speciation” was largely “speculation” two decades ago, at least with respect to a detailed and comprehensive mechanistic understanding of the origin of new species. Despite elegant classical work examining the genetic basis of interspecific differences and reproductive isolation and complementary studies of the ecological factors that can contribute to species divergence, speciation researchers lacked the tools to dissect the specific forces, traits, and genes involved. Thanks to the recent advances in molecular biology and genomic sequencing, detailed study of speciation is becoming feasible in many animal and plant groups. In fact, a dozen of “speciation genes” responsible for reproductive isolation between sibling species have been identified at the molecular level. Further, genetic changes leading to morphological differentiation among related species have been elucidated, supported by phylogenetic analyses at high resolution. We invited investigators to contribute both original research and review articles that would stimulate the continuing efforts to understand speciation and species differentiation from all perspectives, not only the genetic mechanisms but also the ecological and evolutionary causes. Among the seven original articles in this special issue, four were Drosophila studies. Two of them focus on the mechanisms of reproductive isolation. A. Takahashi et al. in “Cuticular hydrocarbon content that affects male mate preference of Drosophila melanogaster from west Africa” identified a polymorphic chemical cue involved in mate recognition between sibling species. Y. H. Ahmed-Braimah and B. F. McAllister in “Rapid evolution of assortative fertilization between recently allopatric species of Drosophila” described an example of postmating/prezygotic isolation, where heterospecific fertilization after mating is compromised due to disruptions in sperm storage and motility. Often, reproductive isolation evolves more rapidly than any morphological traits so that the only way to distinguish recently diverged species is through mating experiments. Y.-F. Li et al. in “DNA barcoding and molecular phylogeny of Drosophila lini and its sibling species” showed that molecular variation can also be widely shared between sibling species despite strong reproductive isolation between them. To understand why reproductive isolation can evolve so rapidly compared to other traits, L. Muller et al. in “Inter- and intraspecific variation in Drosophila genes with sex-biased expression” examined the evolution of gene expression and protein sequences and found that genes with male-biased expression tend to diverge rapidly compared to the rest of the genome. Three other original articles deal with reproductive isolation in vertebrates, specifically fish or reptiles. D. Bierbach et al. in “Divergent evolution of male aggressive behavior: another reproductive isolation barrier in extremophile poeciliid fishes?” reported a rare case study of behavioral isolation via local adaptation to extreme environmental conditions (darkness in caves and toxic hydrogen sulphide). G. M. Kozak et al. in “Postzygotic isolation evolves before prezygotic isolation between fresh and saltwater populations of the rainwater killifish, Lucania parva” discovered a case of incipient reproductive isolation caused by salinity adaption, in which they found no evidence of prezygotic isolation but detected reduced hybrid survival. M. Gabirot et al. in “Differences in chemical sexual signals may promote reproductive isolation and cryptic speciation between Iberian wall lizard populations” reported another case of cryptic speciation caused by pheromonal differentiation, in which they demonstrated that the Iberian wall lizard forms part of a “species complex” with different morphology and different proportions of chemical components in femoral gland secretions of males. This special issue also includes four review articles. A. Ivanovic et al. in “A phenotypic point of view of the adaptive radiation of crested newts (Triturus cristatus superspecies, Caudata, Amphibia)” reviewed the pattern of adaptive radiation in the European crested newt, in which they suggested that phenotypic diversification was caused by heterochronic changes linked to variation in ecological preferences. J. P. Masly in “170 years of “lock-and-key”: genital morphology and reproductive isolation” reviewed the facts and speculations about the role of genital morphology in maintaining species barriers and examined the prospects for identifying the genetic changes responsible for the evolution of genital morphology. D. M. Castillo and L. C. Moyle in “Evolutionary implications of mechanistic models of TE-mediated hybrid incompatibility” reviewed mechanistic models of host-mediated TE suppression in light of the potential role of TE derepression in postzygotic isolation and identified data that would be necessary to provide more satisfactory tests of this hypothesized isolation mechanism. K. Sawamura in “Chromatin evolution and molecular drive in speciation” proposed a general mechanism of hybrid sterility and inviability caused by coevolution between repetitive satellite DNAs and chromatin proteins. Altogether, this is a diverse array of papers that ranges from a classical model of speciation research—Drosophila—to plants and emerging vertebrate system, and from molecular genetic mechanisms through sensory biology to environmentally mediated adaptive divergence. As such, this special issue is representative of the diversity of studies and systems that continue to contribute to our understanding of speciation and the diversity of mechanisms that surely underlie this fundamental evolutionary process. We can only hope that the field, and our understanding, continues to grow so diversely and creatively in the future.

Evolutionary innovation can allow a species access to a new ecological niche, potentially reducing competition with closely related species. While the vast majority of Drosophila flies feed on rotting fruit and other decaying matter, and are harmless to human activity, Drosophila suzukii , which has a morphologically modified ovipositor, is capable of colonizing live fruit that is still in the process of ripening, causing massive agricultural damage. Here, we conducted the first comparative analysis of this species and its close relatives, analysing both ovipositor structure and fruit susceptibility. We found that the ovipositor of the species most closely related to D. suzukii , Drosophila subpulchrella , has a similar number of enlarged, evolutionarily derived bristles, but a notably different overall shape. Like D. suzukii , D. subpulchrella flies are capable of puncturing the skin of raspberries and cherries, but we found no evidence that they could penetrate the thicker skin of two varieties of grapes. More distantly related species, one of which has previously been mistaken for D. suzukii , have blunt ovipositors with small bristles. While they did not penetrate fruit skin in any of the assays, they readily colonized fruit interiors where the skin was broken. Our results suggest that considering evolutionary context may be beneficial to the management of invasive species.

Sexually dimorphic traits play key roles in animal evolution and behavior. Little is known, however, about the mechanisms governing their development and evolution. One recently evolved dimorphic trait is the male-specific abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster, which is repressed in females by the Bric-à-brac (Bab) proteins. To understand the regulation and origin of this trait, we have identified and traced the evolution of the genetic switch controlling dimorphic bab expression. We show that the HOX protein Abdominal-B (ABD-B) and the sex-specific isoforms of Doublesex (DSX) directly regulate a bab cis-regulatory element (CRE). In females, ABD-B and DSX(F) activate bab expression whereas in males DSX(M) directly represses bab, which allows for pigmentation. A new domain of dimorphic bab expression evolved through multiple fine-scale changes within this CRE, whose ancestral role was to regulate other dimorphic features. These findings reveal how new dimorphic characters can emerge from genetic networks regulating pre-existing dimorphic traits.

Over 100 years of studies in Drosophila melanogaster and related species in the genus Drosophila have facilitated key discoveries in genetics, genomics, and evolution. While high-quality genome assemblies exist for several species in this group, they only encompass a small fraction of the genus. Recent advances in long read sequencing allow high quality genome assemblies for tens or even hundreds of species to be generated. Here, we utilize Oxford Nanopore sequencing to build an open community resource of high-quality assemblies for 101 lines of 95 drosophilid species encompassing 14 species groups and 35 sub-groups with an average contig N50 of 10.5 Mb and greater than 97% BUSCO completeness in 97/101 assemblies. These assemblies, along with detailed wet lab protocol and assembly pipelines, are released as a public resource and will serve as a starting point for addressing broad questions of genetics, ecology, and evolution within this key group.

Abstract The vinegar fly Drosophila melanogaster is a pivotal model for invertebrate development, genetics, physiology, neuroscience, and disease. The whole family Drosophilidae, which contains over 4000 species, offers a plethora of cases for comparative and evolutionary studies. Despite a long history of phylogenetic inference, many relationships remain unresolved among the groups and genera in the Drosophilidae. To clarify these relationships, we first developed a set of new genomic markers and assembled a multilocus data set of 17 genes from 704 species of Drosophilidae. We then inferred well-supported group and species trees for this family. Additionally, we were able to determine the phylogenetic position of some previously unplaced species. These results establish a new framework for investigating the evolution of traits in fruit flies, as well as valuable resources for systematics.

Abstract The ability of a single genome to produce distinct and often dramatically different male and female forms is one of the wonders of animal development. In most animals, sex-specific phenotypes are shaped by interactions between a sex determination pathway and spatial patterning gene networks. In Drosophila melanogaster , most sexually dimorphic traits are controlled by sex-specific isoforms of the doublesex ( dsx ) transcription factor, and dsx expression is mostly limited to cells that give rise to sexually dimorphic traits. However, it is unknown how this mosaic of “sex-naïve” and “sex-aware” tissues arises. Here, we characterize the cis -regulatory sequences that control dsx expression in the foreleg, which contains multiple types of sex-specific sensory organs. We find that separate modular enhancers are responsible for dsx expression in each sexually dimorphic organ. Expression of dsx in the sex comb is co-regulated by two enhancers with distinct spatial and temporal specificities that are separated by a genitalia-specific enhancer. Thus, the mosaic of sexually dimorphic and monomorphic organs depends on modular regulation of dsx transcription by dedicated cell type-specific enhancers. Summary Statement We identify the modular cis -regulatory elements that direct expression of doublesex in sexually dimorphic structures in Drosophila legs and genitalia. This regulatory landscape provides insight into how cells obtain their sex-specific identity.

Abstract The evolution of gene expression via cis-regulatory changes is well established as a major driver of phenotypic evolution. However, relatively little is known about the influence of enhancer architecture and intergenic interactions on regulatory evolution. We address this question by examining chemosensory system evolution in Drosophila . D. prolongata males show a massively increased number of chemosensory bristles compared to females and males of sibling species. This increase is driven by sex-specific transformation of ancestrally mechanosensory organs. Consistent with this phenotype, the Pox neuro transcription factor ( Poxn ), which specifies chemosensory bristle identity, shows expanded expression in D. prolongata males. Poxn expression is controlled by non-additive interactions among widely dispersed enhancers. Although some D. prolongata Poxn enhancers show increased activity, the additive component of this increase is slight, suggesting most changes in Poxn expression are due to epistatic interactions between Poxn enhancers and trans-regulatory factors. Indeed, the expansion of D. prolongata Poxn enhancer activity is only observed in cells that express doublesex ( dsx ), the gene that controls sexual differentiation in Drosophila and also shows increased expression in D. prolongata males due to cis -regulatory changes. Although expanded dsx expression may contribute to increased activity of D. prolongata Poxn enhancers, this interaction is not sufficient to explain the full expansion of Poxn expression, suggesting that cis-trans interactions between Poxn , dsx , and additional unknown genes are necessary to produce the derived D. prolongata phenotype. Overall, our results demonstrate the importance of epistatic gene interactions for evolution, particularly when pivotal genes have complex regulatory architecture. Research Highlights In Drosophila prolongata males, many mechanosensory organs are transformed into chemosensory. This is due in part to interacting regulatory changes in Poxn , which controls chemosensory organ development, and dsx , which controls sexual differentiation. Graphical Abstract

Abstract To respond to the world around them, animals rely on the input of a network of sensory organs distributed throughout the body. Distinct classes of sensory organ are specialized for the detection of specific stimuli such as strain, pressure, or taste. The features that underlie this specialization relate both to the neurons that innervate sensory organs and the accessory cells that comprise them. This diversity of cell types, both within and between sensory organs, raises two fundamental questions: what makes these cell types distinct from one another, and how is this diversity generated during development? To address these questions, we performed single-cell RNA sequencing on a developing tissue that displays a wide variety of functionally and structurally distinct sensory organs: the first tarsal segment of the pupal male Drosophila melanogaster foreleg. We characterize the cellular landscape in which the sensory organs reside, identify a novel cell type that contributes to the construction of the neural lamella, and characterize the transcriptomic differences among support cells within and between sensory organs. We identify the genes that distinguish between mechanosensory and chemosensory neurons, resolve a combinatorial transcription factor code that defines four distinct classes of gustatory neuron and several types of mechanosensory neuron, and match the expression of sensory receptors to specific neuron classes. Collectively, our work identifies core genetic features of a variety of sensory organs and provides a rich, annotated resource for studying their development and function.