Various proapoptotic stimuli increase the production of superoxide and H2O2 by mitochondria. Whereas superoxide impairs mitochondrial function and is removed by Mn2+-dependent superoxide dismutase, the role and metabolism of mitochondrial H2O2 during apoptosis have remained unclear. The effects on apoptotic signaling of depletion of peroxiredoxin (Prx) III, a mitochondrion-specific H2O2-scavenging enzyme, have now been investigated by RNA interference in HeLa cells. Depletion of Prx III resulted in increased intracellular levels of H2O2 and sensitized cells to induction of apoptosis by staurosporine or TNF-α. The rates of mitochondrial membrane potential collapse, cytochrome c release, and caspase activation were increased in Prx III-depleted cells, and these effects were reversed by ectopic expression of Prx III or mitochondrion-targeted catalase. Depletion of Prx III also exacerbated damage to mitochondrial macromolecules induced by the proapoptotic stimuli. Our results suggest that Prx III is a critical regulator of the abundance of mitochondrial H2O2, which itself promotes apoptosis in cooperation with other mediators of apoptotic signaling. Various proapoptotic stimuli increase the production of superoxide and H2O2 by mitochondria. Whereas superoxide impairs mitochondrial function and is removed by Mn2+-dependent superoxide dismutase, the role and metabolism of mitochondrial H2O2 during apoptosis have remained unclear. The effects on apoptotic signaling of depletion of peroxiredoxin (Prx) III, a mitochondrion-specific H2O2-scavenging enzyme, have now been investigated by RNA interference in HeLa cells. Depletion of Prx III resulted in increased intracellular levels of H2O2 and sensitized cells to induction of apoptosis by staurosporine or TNF-α. The rates of mitochondrial membrane potential collapse, cytochrome c release, and caspase activation were increased in Prx III-depleted cells, and these effects were reversed by ectopic expression of Prx III or mitochondrion-targeted catalase. Depletion of Prx III also exacerbated damage to mitochondrial macromolecules induced by the proapoptotic stimuli. Our results suggest that Prx III is a critical regulator of the abundance of mitochondrial H2O2, which itself promotes apoptosis in cooperation with other mediators of apoptotic signaling. Normal cellular processes that involve oxygen result in the production of reactive oxygen species (ROS) 1The abbreviations used are: ROS, reactive oxygen species; CHX, cycloheximide; CM-H2DCFDA, 5-(and 6-)chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate; Δψm, mitochondrial membrane potential; DEVD-AMC, Asp-Glu-Val-Asp-(7-amino-4-methylcoumarin); DHR123, dihydrorhodamine 123; GPx, glutathione peroxidase; JC-1, 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanin iodide; mtDNA, mitochondrial DNA; NAO, 10-N-nonyl-acridine orange; PARP, poly(ADP-ribose) polymerase; Prx, peroxiredoxin; PTP, permeability transition pore; RNAi, RNA interference; siRNA, small interfering RNA; SOD, superoxide dismutase; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid; RT, reverse transcriptase.1The abbreviations used are: ROS, reactive oxygen species; CHX, cycloheximide; CM-H2DCFDA, 5-(and 6-)chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate; Δψm, mitochondrial membrane potential; DEVD-AMC, Asp-Glu-Val-Asp-(7-amino-4-methylcoumarin); DHR123, dihydrorhodamine 123; GPx, glutathione peroxidase; JC-1, 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanin iodide; mtDNA, mitochondrial DNA; NAO, 10-N-nonyl-acridine orange; PARP, poly(ADP-ribose) polymerase; Prx, peroxiredoxin; PTP, permeability transition pore; RNAi, RNA interference; siRNA, small interfering RNA; SOD, superoxide dismutase; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid; RT, reverse transcriptase. such as superoxide (O2:, H2O2, and the hydroxyl radical (OH.). Each of these species has the potential to oxidize macromolecules and thereby to induce mutation of DNA, impairment of protein function, and lipid peroxidation. Most ROS in unstimulated mammalian cells are generated as a result of the univalent reduction of molecular oxygen toO2⋅¯ by electrons that leak from the mitochondrial electron transport chain, mainly from complexes I and III (1Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Crossref PubMed Scopus (2086) Google Scholar, 2Cadenas E. Boveris A. Ragan C.I. Stoppani A.O. Arch Biochem. Biophys. 1977; 180: 248-257Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar, 3Turrens J.F. Biosci. Rep. 1997; 17: 3-8Crossref PubMed Scopus (752) Google Scholar). Given its charged nature,O2⋅¯ does not readily cross membranes; therefore, if not destroyed, it inhibits mitochondrial function by inactivating the Fe-S centers in the electron transport chain (complexes I and III) and the tricarboxylic acid cycle (aconitase) (4Wallace D.C. Science. 1999; 283: 1482-1488Crossref PubMed Scopus (2595) Google Scholar). The burden ofO2⋅¯ production is largely countered by Mn2+-dependent superoxide dismutase (MnSOD), an enzyme specifically localized in the mitochondrial matrix (5Chance B. Sies H. Boveris A. Physiol. Rev. 1979; 59: 527-605Crossref PubMed Scopus (4797) Google Scholar). The SOD reaction only partially relieves oxidative stress in mitochondria, however, given that its product, H2O2, is itself a mild oxidant and is readily converted to the more powerful oxidant OH. via the Fenton reaction. Intracellular H2O2 is removed mostly by catalase, glutathione peroxidase (GPx), and peroxiredoxin (Prx). GPx catalyzes the reduction of H2O2 and of various hydroperoxides with glutathione as the electron donor. There are at least four GPx isoforms in mammalian cells. GPx1 is the major isoform and is expressed in all tissues; it is localized predominantly in the cytosol, but a small proportion (∼10%) of GPx1 molecules is also present in the matrix of mitochondria (6Esworthy R.S. Ho Y.S. Chu F.F. Arch Biochem. Biophys. 1997; 340: 59-63Crossref PubMed Scopus (134) Google Scholar, 7Panfili E. Sandri G. Ernster L. FEBS Lett. 1991; 290: 35-37Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 8Legault J. Carrier C. Petrov P. Renard P. Remacle J. Mirault M.E. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 272: 416-422Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar, 9Ho Y.-S. Magnenat J.-L. Bronson R.T. Cao J. Gargano M. Sugawara M. Funk C.D. J. Biol. Chem. 1997; 272: 16644-16651Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (483) Google Scholar). With the exception of those in rat myocytes, mitochondria lack catalase (10Radi R. Turrens J. Chang L. Bush K. Crapo J. Freeman B. J. Biol. Chem. 1991; 266: 22028-22034Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Mitochondria apparently also must import glutathione because they also lack the enzymes required for glutathione synthesis. The newly identified Prx family of peroxidases includes at least six isoforms in mammalian cells (11Chae H. Robison K. Poole L. Church G. Storz G. Rhee S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7017-7021Crossref PubMed Scopus (698) Google Scholar, 12Chae H.Z. Kim H.J. Kang S.W. Rhee S.G. Diabetes Res. Clin. Pract. 1999; 45: 101-112Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar, 13Rhee S.G. Kang S.W. Chang T.S. Jeong W. Kim K. IUBMB Life. 2001; 52: 35-41Crossref PubMed Scopus (512) Google Scholar). Among them, Prx III is synthesized with a mitochondrial targeting sequence, as is MnSOD, and is then transferred to mitochondria, where its targeting residues are cleaved during maturation (12Chae H.Z. Kim H.J. Kang S.W. Rhee S.G. Diabetes Res. Clin. Pract. 1999; 45: 101-112Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar, 13Rhee S.G. Kang S.W. Chang T.S. Jeong W. Kim K. IUBMB Life. 2001; 52: 35-41Crossref PubMed Scopus (512) Google Scholar, 14Araki M. Nanri H. Ejima K. Murasato Y. Fujiwara T. Nakashima Y. Ikeda M. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2271-2278Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (120) Google Scholar). On reaction with H2O2, the redox-sensitive Cys residue of each subunit of the Prx homodimer is oxidized to Cys-SOH, which then reacts with a neighboring Cys-SH of the other subunit to form an intermolecular disulfide (15Seo M.S. Kang S.W. Kim K. Baines I.C. Lee T.H. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 2000; 275: 20346-20354Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (379) Google Scholar). This disulfide is reduced specifically by thioredoxin, not by glutathione or glutaredoxin (15Seo M.S. Kang S.W. Kim K. Baines I.C. Lee T.H. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 2000; 275: 20346-20354Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (379) Google Scholar). The reduced form of thioredoxin is then regenerated by thioredoxin reductase at the expense of NADPH (11Chae H. Robison K. Poole L. Church G. Storz G. Rhee S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7017-7021Crossref PubMed Scopus (698) Google Scholar, 12Chae H.Z. Kim H.J. Kang S.W. Rhee S.G. Diabetes Res. Clin. Pract. 1999; 45: 101-112Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar, 13Rhee S.G. Kang S.W. Chang T.S. Jeong W. Kim K. IUBMB Life. 2001; 52: 35-41Crossref PubMed Scopus (512) Google Scholar). Mammalian mitochondria contain thioredoxin 2 and thioredoxin reductase 2, both of which are synthesized in the cytosol with mitochondrial targeting sequences and become localized specifically in mitochondria (16Spyrou G. Enmark E. Miranda-Vizuete A. Gustafsson J.-A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2936-2941Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (332) Google Scholar, 17Lee S.-R. Kim J.-R. Kwon K.-S. Yoon H.W. Levine R.L. Ginsburg A. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1999; 274: 4722-4734Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (242) Google Scholar). Mitochondria play a central role in apoptosis by releasing cytochrome c and other proapoptotic proteins (reviewed in Refs. 18Green D.R. Reed J.C. Science. 1998; 281: 1309-1312Crossref PubMed Google Scholar, 19Wang X. Genes Dev. 2001; 15: 2922-2933Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 20Newmeyer D.D. Ferguson-Miller S. Cell. 2003; 112: 481-490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1073) Google Scholar, 21Kroemer G. Reed J.C. Nat. Med. 2000; 6: 513-519Crossref PubMed Scopus (2762) Google Scholar). The release of cytochrome c into the cytosol results in the activation of caspases by triggering formation of the apoptosome (22Thornberry N.A. Lazebnik Y. Science. 1998; 281: 1312-1316Crossref PubMed Scopus (6138) Google Scholar, 23Budihardjo I. Oliver H. Lutter M. Luo X. Wang X. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999; 15: 269-290Crossref PubMed Scopus (2253) Google Scholar). The mitochondrial production of ROS is also thought to be associated with the activation and propagation of apoptosis (4Wallace D.C. Science. 1999; 283: 1482-1488Crossref PubMed Scopus (2595) Google Scholar, 20Newmeyer D.D. Ferguson-Miller S. Cell. 2003; 112: 481-490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1073) Google Scholar, 21Kroemer G. Reed J.C. Nat. Med. 2000; 6: 513-519Crossref PubMed Scopus (2762) Google Scholar, 24Gottlieb E. Vander Heiden M.G. Thompson C.B. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 5680-5689Crossref PubMed Scopus (308) Google Scholar, 25Hildeman D.A. Mitchell T. Teague T.K. Henson P. Day B.J. Kappler J. Marrack P.C. Immunity. 1999; 10: 735-744Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (401) Google Scholar, 26Jacobson M.D. Trends Biochem. Sci. 1996; 21: 83-86Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (728) Google Scholar, 27Hockenbery D.M. Oltvai Z.N. Yin X.M. Milliman C.L. Korsmeyer S.J. Cell. 1993; 75: 241-251Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3289) Google Scholar, 28Ricci J.-E. Gottlieb R.A. Green D.R. J. Cell Biol. 2003; 160: 65-75Crossref PubMed Scopus (419) Google Scholar). Indeed, generation of ROS by mitochondria appears to be an early event in apoptotic signaling initiated by TNF-α, ceramide, or glutamate (29Schulze-Osthoff K. Bakker A. Vanhaesebroeck B. Beyaert R. Jacob W. Fiers W. J. Biol. Chem. 1992; 267: 5317-5323Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 30Goossens V. Grooten J. Vos K. Fiers W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 8115-8119Crossref PubMed Scopus (555) Google Scholar, 31Garg A.K. Aggarwal B.B. Mol. Immunol. 2002; 39: 509-517Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar, 32Kruman I. Guo Q. Mattson M.P. J. Neurosci. Res. 1998; 51: 293-308Crossref PubMed Scopus (343) Google Scholar, 33Tan S. Sagara Y. Liu Y. Maher P. Schubert D. J. Cell Biol. 1998; 141: 1423-1432Crossref PubMed Scopus (643) Google Scholar, 34Zamzami N. Marchetti P. Castedo M. Decaudin D. Macho A. Hirsch T. Susin S.A. Petit P.X. Mignotte B. Kroemer G. J. Exp. Med. 1995; 182: 367-377Crossref PubMed Scopus (1424) Google Scholar), whereas other studies suggest that ROS production occurs relatively late in cells that have already committed to die (35Jacobson M.D. Raff M.C. Nature. 1995; 374: 814-816Crossref PubMed Scopus (635) Google Scholar, 36Shimizu S. Eguchi Y. Kosaka H. Kamiike W. Matsuda H. Tsujimoto Y. Nature. 1995; 374: 811-813Crossref PubMed Scopus (624) Google Scholar). Most of these various observations, however, did not make a distinction betweenO2⋅¯ and H2O2, the former of which preferentially oxidizes certain metal ions whereas the latter oxidizes cysteine and methionine residues. An important role forO2⋅¯ in apoptotic signaling was previously suggested by the observations that overexpression of MnSOD conferred increased resistance to TNF-α-induced cytotoxicity, that expression of MnSOD antisense RNA increased the sensitivity of cells to TNF-α, and that induction of MnSOD expression in cells was protective under various proapoptotic conditions (37Kops G.J. Dansen T.B. Polderman P.E. Saarloos I. Wirtz K.W. Coffer P.J. Huang T.T. Bos J.L. Medema R.H. Burgering B.M. Nature. 2002; 419: 316-321Crossref PubMed Scopus (1253) Google Scholar, 38Li J.J. Oberley L.W. Cancer Res. 1997; 57: 1991-1998PubMed Google Scholar, 39Wong G.H. Elwell J.H. Oberley L.W. Goeddel D.V. Cell. 1989; 58: 923-931Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (764) Google Scholar, 40Wong G.H. Goeddel D.V. Science. 1988; 242: 941-944Crossref PubMed Scopus (836) Google Scholar). Homozygous knockout of the MnSOD gene is lethal in mice, whereas mice that lack cytosolic SOD (Cu/ZnSOD) appear normal (41Li Y. Huang T.T. Carlson E.J. Melov S. Ursell P.C. Olson J.L. Noble L.J. Yoshimura M.P. Berger C. Chan P.H. Wallace D.C. Epstein C.J. Nat. Genet. 1995; 11: 376-381Crossref PubMed Scopus (1444) Google Scholar, 42Lebovitz R.M. Zhang H. Vogel H. Cartwright Jr., J. Dionne L. Lu N. Huang S. Matzuk M.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 9782-9787Crossref PubMed Scopus (828) Google Scholar). Experiments with heterozygous MnSOD knockout mice or cell lines derived from these animals have shown that the partial deficiency of MnSOD promotes cellular apoptotic events, such as cytochrome c release and the permeability transition of mitochondria, under various conditions (43Fujimura M. Morita-Fujimura Y. Kawase M. Copin J.-C. Calagui B. Epstein C.J. Chan P.H. J. Neurosci. 1999; 19: 3414-3422Crossref PubMed Google Scholar, 44Kokoszka J.E. Coskun P. Esposito L.A. Wallace D.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 2278-2283Crossref PubMed Scopus (378) Google Scholar, 45Van Remmen H. Williams M.D. Guo Z. Estlack L. Yang H. Carlson E.J. Epstein C.J. Huang T.T. Richardson A. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001; 281: H1422-H1432Crossref PubMed Google Scholar). Deficiency of MnSOD activity was also associated with increased damage to mitochondrial proteins such as aconitase and NADH dehydrogenase (45Van Remmen H. Williams M.D. Guo Z. Estlack L. Yang H. Carlson E.J. Epstein C.J. Huang T.T. Richardson A. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001; 281: H1422-H1432Crossref PubMed Google Scholar). UnlikeO2⋅¯, whose effects on mitochondrial function are well established, the effects of H2O2 production in mitochondria remain unclear. Given the absence of catalase from mitochondria in most cell types, GPx1 has been thought to play the major role in the protection of these organelles against oxidative damage by H2O2 (3Turrens J.F. Biosci. Rep. 1997; 17: 3-8Crossref PubMed Scopus (752) Google Scholar, 44Kokoszka J.E. Coskun P. Esposito L.A. Wallace D.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 2278-2283Crossref PubMed Scopus (378) Google Scholar, 46Makino N. Mochizuki Y. Bannai S. Sugita Y. J. Biol. Chem. 1994; 269: 1020-1025Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 47Jones D.P. Eklow L. Thor H. Orrenius S. Arch. Biochem. Biophys. 1981; 210: 505-516Crossref PubMed Scopus (273) Google Scholar, 48de Haan J.B. Bladier C. Griffiths P. Kelner M. O'Shea R.D. Cheung N.S. Bronson R.T. Silvestro M.J. Wild S. Zheng S.S. Beart P.M. Hertzog P.J. Kola I. J. Biol. Chem. 1998; 273: 22528-22536Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (378) Google Scholar, 49Boveris A. Cadenas E. IUBMB Life. 2000; 50: 245-250Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar, 50Cadenas E. Mol. Aspects Med. 2004; 25: 17-26Crossref PubMed Scopus (346) Google Scholar). However, homozygous GPx1 knockout mice appear healthy and do not manifest an increased sensitivity to hyperoxia or an increased content of protein carbonyl groups or lipid peroxides (9Ho Y.-S. Magnenat J.-L. Bronson R.T. Cao J. Gargano M. Sugawara M. Funk C.D. J. Biol. Chem. 1997; 272: 16644-16651Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (483) Google Scholar). Furthermore, hepatocytes isolated from these animals did not show an enhanced sensitivity to apoptosis initiated by TNF-α receptors or Fas (51Bajt M.L. Ho Y.S. Vonderfecht S.L. Jaeschke H. Antioxid. Redox Signal. 2002; 4: 733-740Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar). A protective role for GPx1 became apparent, however, when the GPx1 knockout and control mice, or cell lines derived from these animals, were subjected to extreme oxidative stress such as that associated with ischemia-reperfusion injury or treatment with paraquat or a bolus of H2O2 (48de Haan J.B. Bladier C. Griffiths P. Kelner M. O'Shea R.D. Cheung N.S. Bronson R.T. Silvestro M.J. Wild S. Zheng S.S. Beart P.M. Hertzog P.J. Kola I. J. Biol. Chem. 1998; 273: 22528-22536Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (378) Google Scholar, 52Crack P.J. Taylor J.M. Flentjar N.J. de Haan J. Hertzog P. Iannello R.C. Kola I. J. Neurochem. 2001; 78: 1389-1399Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). It remains unclear whether the effect of GPx1 knockout under these conditions was attributable to the absence of the enzyme from the cytosol or from mitochondria, or from both. The specific localization of Prx III in mitochondria (12Chae H.Z. Kim H.J. Kang S.W. Rhee S.G. Diabetes Res. Clin. Pract. 1999; 45: 101-112Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar, 13Rhee S.G. Kang S.W. Chang T.S. Jeong W. Kim K. IUBMB Life. 2001; 52: 35-41Crossref PubMed Scopus (512) Google Scholar, 14Araki M. Nanri H. Ejima K. Murasato Y. Fujiwara T. Nakashima Y. Ikeda M. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2271-2278Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (120) Google Scholar) together with the identification of its mitochondria-specific electron suppliers, namely thioredoxin 2 and thioredoxin reductase 2 (16Spyrou G. Enmark E. Miranda-Vizuete A. Gustafsson J.-A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2936-2941Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (332) Google Scholar, 17Lee S.-R. Kim J.-R. Kwon K.-S. Yoon H.W. Levine R.L. Ginsburg A. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1999; 274: 4722-4734Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (242) Google Scholar), suggest that these three proteins might provide a primary line of defense against H2O2 produced by the mitochondrial respiratory chain (53Miranda-Vizuete A. Damdimopoulos A.E. Spyrou G. Antioxid. Redox Signal. 2000; 2: 801-810Crossref PubMed Scopus (118) Google Scholar, 54Pedrajas J.R. Miranda-Vizuete A. Javanmardy N. Gustafsson J.-A. Spyrou G. J. Biol. Chem. 2000; 275: 16296-16301Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (152) Google Scholar), as MnSOD does againstO2⋅¯. The role of Prx III in mitochondria has not been defined, however. Therefore, with the use of RNA interference (RNAi), we have now investigated the effects of depletion of endogenous Prx III on oxidative damage to mitochondrial components and on apoptotic events. Our results indicate that Prx III is much more abundant in mitochondria than is GPx1 and is a critical regulator of the mitochondrial H2O2 concentration, in contrast to the widely held view that GPx1 is the only important H2O2-metabolizing enzyme in mitochondria (3Turrens J.F. Biosci. Rep. 1997; 17: 3-8Crossref PubMed Scopus (752) Google Scholar, 44Kokoszka J.E. Coskun P. Esposito L.A. Wallace D.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 2278-2283Crossref PubMed Scopus (378) Google Scholar, 48de Haan J.B. Bladier C. Griffiths P. Kelner M. O'Shea R.D. Cheung N.S. Bronson R.T. Silvestro M.J. Wild S. Zheng S.S. Beart P.M. Hertzog P.J. Kola I. J. Biol. Chem. 1998; 273: 22528-22536Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (378) Google Scholar, 49Boveris A. Cadenas E. IUBMB Life. 2000; 50: 245-250Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar, 50Cadenas E. Mol. Aspects Med. 2004; 25: 17-26Crossref PubMed Scopus (346) Google Scholar). We further demonstrate a regulatory function for Prx III during apoptosis induced by staurosporine or TNF-α. Depletion of Prx III by RNAi—A small interfering RNA (siRNA) duplex targeting the 5′-AAGCCAAGUCCAGCUGCUUCC-3′ sequence in the open reading frame of human Prx III mRNA as well as siCONTROL® non-targeting siRNA were obtained from Dharmacon Research (Lafayette, CO). The RNAs were introduced into HeLa cells by transfection with the use of a Nucleofector instrument (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany). Preparation of Recombinant Proteins—The DNA sequence for human GPx1 was amplified by PCR from HeLa cell cDNA and cloned into the NdeI and EcoRI sites of pET17b (Novagen, Madison, WI). The resulting plasmid, pET17b-GPx1, was subjected to site-directed mutagenesis with the primers 5′-TGGCGTCCCTCTGCGGCACCACGGT-3′ and 5′-ACCGTGGTGCCGCAGAGGGACGCCA-3′ (mutated residue in bold) in order to replace selenocysteine at position 47 with cysteine. Escherichia coli BL21(DE3) cells harboring the mutated plasmid were cultured in Luria-Bertani broth and expression of the recombinant protein was induced by incubation of the cells for 3 h with 1 mm isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside. The cells were harvested by centrifugation at 12,000 × g for 10 min at 4 °C, resuspended in 10 vol of ice-cold extraction buffer (20 mm Tris-HCl, pH 7.5, 10 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0.5 mm aminoethylbenzene sulfonyl fluoride, 5 mm dithiothreitol), and then disrupted by pressure. After centrifugation of the cell lysate at 12,000 × g for 30 min at 4 °C, the supernatant was treated immediately on ice with streptomycin sulfate (final concentration, 1%) for 30 min and then centrifuged again at 12,000 × g for 30 min at 4 °C to remove the precipitated nucleic acid. Human GPx1 was purified from the resulting supernatant by a series of chromatographic steps including HPLC on TSK DEAE-5PW and TSK phenyl-5PW columns (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) as well as gel filtration on Superose-6 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Recombinant human Prx III was expressed in E. coli and purified as described previously (12Chae H.Z. Kim H.J. Kang S.W. Rhee S.G. Diabetes Res. Clin. Pract. 1999; 45: 101-112Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar). Induction of Apoptosis—HeLa cells were exposed for the indicated times to 200 nm staurosporine (Calbiochem, San Diego, CA) or to the combination of TNF-α (15 ng/ml) (Invitrogen, La Jolla, CA) and cycloheximide (CHX) (10 μg/ml). Subcellular Fractionation—Cytosolic and mitochondria-enriched fractions were prepared from HeLa cells with the use of a Subcellular Proteome Extraction kit (Calbiochem). Immunoblot Analysis—HeLa cell lysates were prepared and immunoblot analysis was performed as described previously (55Chang T.S. Jeong W. Choi S.Y. Yu S. Kang S.W. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 2002; 277: 25370-25376Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (212) Google Scholar). Monoclonal antibodies to poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) and to cytochrome c were obtained from BD PharMingen (San Diego, CA), those to β-actin were from Abcam (Cambridge, UK), polyclonal antibodies to caspase-3 and to caspase-9 were from Cell Signaling Technology (Beverly, MA), those to GPx1 were from LabFrontier (Seoul, Korea), and rabbit antiserum to Prx III, Prx I, and thioredoxin reductase 2 were described previously (12Chae H.Z. Kim H.J. Kang S.W. Rhee S.G. Diabetes Res. Clin. Pract. 1999; 45: 101-112Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar, 17Lee S.-R. Kim J.-R. Kwon K.-S. Yoon H.W. Levine R.L. Ginsburg A. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1999; 274: 4722-4734Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (242) Google Scholar). Carbonylated proteins in the mitochondrial fraction were labeled by derivatization of the carbonyl groups with 2,4-dinitrophenylhydrazine and then detected with antibodies specific for the latter moiety (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA) (56, Levine, R. L., Wehr, N., Williams, J. A., Stadtman, E. R., and Shacter, E. (2000) Methods In Molecular Biology, Vol. 99, pp. 15-24, Clifton, NJ.Google Scholar). Assay of Caspase-3 Activity—Caspase-3 activity was assayed by incubating cell lysate (10 μg of protein) with 200 μl of reaction buffer (100 mm Hepes-KOH (pH 7.5), 10% (w/v) sucrose, 0.1% CHAPS, 10 mm dithiothreitol) containing 25 μm Asp-Glu-Val-Asp-(7-amino-4-methylcoumarin) (DEVD-AMC) (Biomol, Plymouth Meeting, PA). The fluorescence generated by cleavage of the artificial substrate was measured with a CytoFluor 4000 instrument (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) at excitation and emission wavelengths of 380 and 460 nm, respectively. Confocal Microscopy—Cells on coverslips were fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized for 5 min with 0.2% Triton X-100. Endogenous Prx III was detected with specific antiserum (1:50 dilution) and Alexa-488-conjugated goat antibodies to rabbit IgG (Molecular Probes, Eugene, OR). Mitochondria were stained with 0.1 μm MitoTracker Red CMXRos and nuclei were stained with Hoechst 33342 (10 μg/ml), both from Molecular Probes. Confocal fluorescence images were obtained with an LSM510 microscope (Carl Zeiss, Tornwood, NJ). Apoptotic cells were quantified as a percentage of total cells on the basis of their condensed or fragmented nuclei as revealed by the Hoechst dye; at least 300 cells from five random fields were scored for each sample. Flow Cytometry—A FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences) was used for all analyses, with a minimum of 2 × 104 cells per sample for each measurement. The excitation wavelength was 488 nm, and the observation wavelength was 530 nm for green fluorescence and 585 nm for red fluorescence. Relative change in fluorescence was analyzed with WinMDI software. For analysis of apoptosis, cells were stained with propidium iodide (25 μg/ml) as described previously (55Chang T.S. Jeong W. Choi S.Y. Yu S. Kang S.W. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 2002; 277: 25370-25376Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (212) Google Scholar) and the percentage of hypodiploid (apoptotic) cells was determined. For evaluation of cardiolipin peroxidation, cells were labeled with 5 μm 10-N-nonylacridine orange (NAO) (Molecular Probes) for 30 min and washed twice before measurement of the fluorescence emitted by cardiolipin-bound NAO. For evaluation of changes in the mitochondrial membrane potential (Δψm), cells (4 × 105) were incubated with 10 μg/ml of 5,5′, 6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanin iodide (JC-1) (Molecular Probes) for 20 min at 37 °C and the shifts in both red and green fluorescence emissions of JC-1 were measured. Measurement of ROS—For measurement of intracellular ROS, detached cells were loaded with 5 μm 5,6-chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (CM-H2DCFDA) (Molecular Probes) at 37 °C for 20 min, washed, and then analyzed immediately by flow cytometry. Direct visualization of mitochondrial ROS generation was achieved with the use of dihydrorhodamine 123 (DHR123) (Molecular Probes). To verify that mitochondria were indeed the site of ROS formation, we incubated cells with both 1 μm DHR123 and 1 μm MitoTracker Red for 20 min at 37 °C. Cells loaded with the fluorescent probes were imaged with an LSM510 confocal microscope fitted with an objective with a magnification of ×40 and an NA of 1.3. Excitation was performed at 458 nm for R123 and at 543 nm for Mitotracker Red. R123 fluorescence was passed through a 505/530-nm band-pass filter. Mitotracker Red fluorescence was passed through a 560-nm long-pass filter. For overlaid images, exposures were collected for equal times at the same plane of focus for both excitation wavelengths; the images were overlaid with a computer and R123 fluorescence was analyzed with MetaMorph software (Universal Imaging, Westchester, PA). Quantitative RT-PCR—Total RNA was extracted from cells with the use of an RNeasy kit (Qiagen) and portions (2 μg) were subjected to reverse transcription in a final volume of 20 μl also with the use of a kit (Invitrogen). The resulting first-strand cDNA was diluted and used as a template for real-time PCR analysis with an ABI 7700 sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA). A fluorogenic probe (5′-6-FAM-CTGTGGAGCAAACC-TAMRA-3′, where 6-FAM is 6-carboxyfluorescein and TAMRA is 6-carboxy-N,N,N′,N′-tetramethylrhodamine and primer pair (5′-GGTATACTACGGTCAATGCTCTGAAA-3′, 5′-ACGATGGGCATGAAACTG-3′) for human cytochrome c oxidase were designed with the use of ABI Primer Express software (Applied Biosystems). Reactions for each sample were performed in triplicate with equal amounts of template cDNA. The amount of cytochrome c oxidase mRNA was normalized by that of human 18 S

Summary

 Spatial barcoding technologies have the potential to reveal histological details of transcriptomic profiles; however, they are currently limited by their low resolution. Here, we report Seq-Scope, a spatial barcoding technology with a resolution comparable to an optical microscope. Seq-Scope is based on a solid-phase amplification of randomly barcoded single-molecule oligonucleotides using an Illumina sequencing platform. The resulting clusters annotated with spatial coordinates are processed to expose RNA-capture moiety. These RNA-capturing barcoded clusters define the pixels of Seq-Scope that are ∼0.5–0.8 μm apart from each other. From tissue sections, Seq-Scope visualizes spatial transcriptome heterogeneity at multiple histological scales, including tissue zonation according to the portal-central (liver), crypt-surface (colon) and inflammation-fibrosis (injured liver) axes, cellular components including single-cell types and subtypes, and subcellular architectures of nucleus and cytoplasm. Seq-Scope is quick, straightforward, precise, and easy-to-implement and makes spatial single-cell analysis accessible to a wide group of biomedical researchers.

A specific and sensitive fluorescence-based method was developed for the imaging of microbe-induced HOCl production. Furthermore, we demonstrate dual oxidase (DUOX)-mediated HOCl generation in the mucosa of live animals providing a novel insight into mucosal innate immunity.

Acne affects 1 in 10 people globally, often resulting in disfigurement. The disease involves excess production of lipids, particularly squalene, increased growth of Cutibacterium acnes , and a host inflammatory response with foamy macrophages. By combining single-cell and spatial RNA sequencing as well as ultrahigh-resolution Seq-Scope analyses of early acne lesions on back skin, we identified TREM2 macrophages expressing lipid metabolism and proinflammatory gene programs in proximity to hair follicle epithelium expressing squalene epoxidase. We established that the addition of squalene induced differentiation of TREM2 macrophages in vitro, which were unable to kill C. acnes . The addition of squalene to macrophages inhibited induction of oxidative enzymes and scavenged oxygen free radicals, providing an explanation for the efficacy of topical benzoyl peroxide in the clinical treatment of acne. The present work has elucidated the mechanisms by which TREM2 macrophages and unsaturated lipids, similar to their involvement in atherosclerosis, may contribute to the pathogenesis of acne.

Abstract Spatial barcoding technologies have the potential to reveal histological details of transcriptomic profiles; however, they are currently limited by their low resolution. Here we report Seq-Scope, a spatial barcoding technology with a resolution almost comparable to an optical microscope. Seq-Scope is based on a solid-phase amplification of randomly barcoded single-molecule oligonucleotides using an Illumina sequencing-by-synthesis platform. The resulting clusters annotated with spatial coordinates are processed to expose RNA-capture moiety. These RNA-capturing barcoded clusters define the pixels of Seq-Scope that are approximately 0.5-1 μm apart from each other. From tissue sections, Seq-Scope visualizes spatial transcriptome heterogeneity at multiple histological scales, including tissue zonation according to the portal-central (liver), crypt-surface (colon) and inflammation-fibrosis (injured liver) axes, cellular components including single cell types and subtypes, and subcellular architectures of nucleus, cytoplasm and mitochondria. Seq-scope is quick, straightforward and easy-to-implement, and makes spatial single cell analysis accessible to a wide group of biomedical researchers.

ABSTRACT Spatial transcriptomics (ST) technologies represent a significant advance in gene expression studies, aiming to profile the entire transcriptome from a single histological slide. These techniques are designed to overcome the constraints faced by traditional methods such as immunostaining and RNA in situ hybridization, which are capable of analyzing only a few target genes simultaneously. However, the application of ST in histopathological analysis is also limited by several factors, including low resolution, a limited range of genes, scalability issues, high cost, and the need for sophisticated equipment and complex methodologies. Seq-Scope—a recently developed novel technology—repurposes the Illumina sequencing platform for high-resolution, high-content spatial transcriptome analysis, thereby overcoming these limitations. Here we provide a detailed step-by-step protocol to implement Seq-Scope with an Illumina NovaSeq 6000 sequencing flow cell that allows for the profiling of multiple tissue sections in an area of 7 mm × 7 mm or larger. In addition to detailing how to prepare a frozen tissue section for both histological imaging and sequencing library preparation, we provide comprehensive instructions and a streamlined computational pipeline to integrate histological and transcriptomic data for high-resolution spatial analysis. This includes the use of conventional software tools for single cell and spatial analysis, as well as our recently developed segmentation-free method for analyzing spatial data at submicrometer resolution. Given its adaptability across various biological tissues, Seq-Scope establishes itself as an invaluable tool for researchers in molecular biology and histology. KEY POINTS The protocol outlines a method for repurposing an Illumina NovaSeq 6000 flow cell as a spatial transcriptomics array, enabling the generation of high-resolution spatial datasets. The protocol introduces a streamlined data analysis pipeline that produces a spatial digital gene expression matrix suitable for various single-cell and spatial transcriptome analysis methods. The protocol allows for the capture of histology images from the same tissue section subjected to spatial transcriptomics analysis and allows users to precisely align the transcriptome dataset with the histological image using fiducial marks engraved on the flow cell surface. Leveraging commonly available Illumina equipment, the protocol offers researchers ultra-high submicrometer resolution in spatial transcriptomics analysis with a comprehensive pipeline, rapid turnaround, cost efficiency, and versatility.

Abstract Skeletal muscle is essential for both movement and metabolic processes, characterized by a complex and ordered structure. Despite its importance, a detailed spatial map of gene expression within muscle tissue has been challenging to achieve due to the limitations of existing technologies, which struggle to provide high-resolution views. In this study, we leverage the Seq-Scope technique, an innovative method that allows for the observation of the entire transcriptome at an unprecedented submicron spatial resolution. By applying this technique to the mouse soleus muscle, we analyze and compare the gene expression profiles in both healthy conditions and following denervation, a process that mimics aspects of muscle aging. Our approach reveals detailed characteristics of muscle fibers, other cell types present within the muscle, and specific subcellular structures such as the postsynaptic nuclei at neuromuscular junctions, hybrid muscle fibers, and areas of localized expression of genes responsive to muscle injury, along with their histological context. The findings of this research significantly enhance our understanding of the diversity within the muscle cell transcriptome and its variation in response to denervation, a key factor in the decline of muscle function with age. This breakthrough in spatial transcriptomics not only deepens our knowledge of muscle biology but also sets the stage for the development of new therapeutic strategies aimed at mitigating the effects of aging on muscle health, thereby offering a more comprehensive insight into the mechanisms of muscle maintenance and degeneration in the context of aging and disease.

Spatial transcriptomics (ST) technologies have advanced to enable transcriptome-wide gene expression analysis at submicrometer resolution over large areas. Analysis of high-resolution ST data relies heavily on image-based cell segmentation or gridding, which often fails in complex tissues due to diversity and irregularity of cell size and shape. Existing segmentation-free analysis methods scale only to small regions and a small number of genes, limiting their utility in high-throughput studies. Here we present FICTURE, a segmentation-free spatial factorization method that can handle transcriptome-wide data labeled with billions of submicron resolution spatial coordinates. FICTURE is orders of magnitude more efficient than existing methods and it is compatible with both sequencing- and imaging-based ST data. FICTURE reveals the microscopic ST architecture for challenging tissues, such as vascular, fibrotic, muscular, and lipid-laden areas in real data where previous methods failed. FICTURE9s cross-platform generality, scalability, and precision make it a powerful tool for exploring high-resolution ST.

During nutritional overload and obesity, hepatocyte function is grossly altered, and a subset of hepatocytes begins to accumulate fat droplets, leading to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Recent single cell studies revealed how non-parenchymal cells, such as macrophages, hepatic stellate cells, and endothelial cells, heterogeneously respond to NAFLD. However, it remains to be characterized how hepatocytes, the major constituents of the liver, respond to nutritional overload in NAFLD. Here, using droplet-based single cell RNA-sequencing (Drop-seq), we characterized how the transcriptomic landscape of individual hepatocytes is altered in response to high-fat diet (HFD) and NAFLD. We showed that entire hepatocytes population undergoes substantial transcriptome changes upon HFD, although the patterns of alteration were highly heterogeneous with zonation-dependent and -independent effects. Periportal (zone 1) hepatocytes downregulated many zone 1-specific marker genes, while a small number of genes mediating gluconeogenesis were upregulated. Pericentral (zone 3) hepatocytes also downregulated many zone 3-specific genes; however, they upregulated several genes that promote HFD-induced fat droplet formation, consistent with findings that zone 3 hepatocytes accumulate more lipid droplets. Zone 3 hepatocytes also upregulated ketogenic pathways as an adaptive mechanism to HFD. Interestingly, many of the top HFD-induced genes, which encode proteins regulating lipid metabolism, were strongly co-expressed with each other in a subset of hepatocytes, producing a variegated pattern of spatial co-localization that is independent of metabolic zonation. In conclusion, our current dataset provides a useful resource for understanding hepatocellular alteration during NAFLD at single cell level.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.