Abstract Background Type 2 diabetes (T2D) is a heterogeneous disease with well-known genetic and environmental risk factors contributing to its prevalence. Epigenetic mechanisms related to changes in DNA methylation (DNAm), may also contribute to T2D risk, but larger studies are required to discover novel markers, and to confirm existing ones. Results We performed a large meta-analysis of individual epigenome-wide association studies (EWAS) of prevalent T2D conducted in four European studies using peripheral blood DNAm. Analysis of differentially methylated regions (DMR) was also undertaken, based on the meta-analysis results. We found three novel CpGs associated with prevalent T2D in Europeans at cg00144180 ( HDAC4 ), cg16765088 (near SYNM ) and cg24704287 (near MIR23A ) and confirmed three CpGs previously identified (mapping to TXNIP , ABCG1 and CPT1A ). We also identified 77 T2D associated DMRs, most of them hypomethylated in T2D cases versus controls. In adjusted regressions among diabetic-free participants in ALSPAC, we found that all six CpGs identified in the meta-EWAS were associated with white cell-types. We estimated that these six CpGs captured 11% of the variation in T2D, which was similar to the variation explained by the model including only the common risk factors of BMI, sex, age and smoking ( R 2 = 10.6%). Conclusions This study identifies novel loci associated with T2D in Europeans. We also demonstrate associations of the same loci with other traits. Future studies should investigate if our findings are generalizable in non-European populations, and potential roles of these epigenetic markers in T2D etiology or in determining long term consequences of T2D.

ABSTRACT Attention-deficit and hyperactivity disorder (ADHD) is a common childhood disorder with a substantial genetic component. However, the extent to which epigenetic mechanisms play a role in the etiology of the disorder is not known. We performed epigenome-wide association studies (EWAS) within the Pregnancy And Childhood Epigenetics (PACE) Consortium to identify DNA methylation sites associated with ADHD symptoms at two methylation assessment periods: birth and school-age. We examined associations of DNA methylation in cord blood with repeatedly assessed ADHD symptoms (age range 4-15 years) in 2477 children from five cohorts and DNA methylation at school-age with concurrent ADHD symptoms (age 7-11 years) in 2374 children from ten cohorts. CpGs identified with nominal significance (p<0.05) in either of the EWAS were correlated between timepoints (ρ=0.30), suggesting overlap in associations, however, top signals were very different. At birth, we identified nine CpGs that were associated with later ADHD symptoms (P<1*10 −7 ), including ERC2 and CREB5. Peripheral blood DNA methylation at one of these CpGs (cg01271805 located in the promotor region of ERC2, which regulates neurotransmitter release) was previously associated with brain methylation. Another (cg25520701) lies within the gene body of CREB5, which was associated with neurite outgrowth and an ADHD diagnosis in previous studies. In contrast, at school-age, no CpGs were associated with ADHD with P<1*10 −7 . In conclusion, we found evidence in this study that DNA methylation at birth is associated with ADHD. Future studies are needed to confirm the utility of methylation variation as biomarker and its involvement in causal pathways.

Some evidence suggests that light-to-moderate alcohol consumption during pregnancy is associated with adverse outcomes in the offspring, but the precise biological mechanisms underlying such associations are currently unknown. Epigenetic modifications have been suggested as one potential explanation. Within the Pregnancy and Childhood Epigenetics (PACE) consortium, we performed meta-analysis to combine information from six population-based birth cohort studies to investigate DNA methylation at over 450,000 sites in the cord blood of newborns differentially exposed to alcohol in utero. We were primarily interested in the effects of sustained consumption throughout pregnancy (data available for five cohorts, 3,075 mother-child pairs), which represents a prolonged prenatal exposure to alcohol, but we also explored binge-drinking and timing-specific exposures. In addition to looking for differential methylation at individual CpG sites, we also used two different methods, Comb-P and DMRcate, to identify differentially methylated regions (DMRs). We found no strong evidence of association between any of our alcohol exposure measures and DNA methylation at any individual CpG site. Using Comb-P, we identified 19 DMRs in the offspring of mothers who drank throughout pregnancy compared to the offspring of mothers who gave up drinking at the start of pregnancy, but these were not validated using DMRcate. In this multi-cohort study of the general population we found no evidence that maternal alcohol consumption during pregnancy is associated with offspring cord blood DNA methylation, which is in stark contrast to the multiple, strong associations that previous studies have found for maternal smoking. However, it is possible that a combination of a larger sample size, higher doses, different timings of exposure and a more global assessment of genomic DNA methylation might show evidence of association.

ABSTRACT Cognitive skills are a strong predictor of a wide range of later life outcomes. Genetic and epigenetic associations across the genome explain some of the variation in general cognitive abilities in the general population and it is plausible that epigenetic associations might arise from prenatal environmental exposures and/or genetic variation early in life. We investigated the association between cord blood DNA methylation at birth and cognitive skills assessed in children from eight pregnancy cohorts (N=2196-3798) within the Pregnancy And Childhood Epigenetics (PACE) Consortium across overall, verbal and non-verbal cognitive scores. The associations at single CpG sites were weak for all of the cognitive domains investigated. One region near DUSP22 on chromosome 6 was associated with non-verbal cognition in a model adjusted for maternal IQ. We conclude that there is little evidence to support the idea that cord blood DNA methylation at single CpGs can predict cognitive skills and further studies are needed to confirm regional differences.

High levels of prenatal alcohol exposure are known to cause an array of adverse outcomes including foetal alcohol syndrome (FAS); however, the effects of low to moderate exposure are less-well characterised. Previous findings suggest that differences in normal-range facial morphology may be a marker for alcohol exposure and related adverse effects. Therefore, in the Avon Longitudinal Study of Parents and Children, we tested for an association between maternal alcohol consumption and six FAS-related facial phenotypes in their offspring, using both self-report questionnaires and the maternal genotype at rs1229984 in ADH1B as measures of maternal alcohol consumption. In both self-reported alcohol consumption (N=4,233) and rs1229984 genotype (N=3,139) analyses, we found no strong statistical evidence for an association between maternal alcohol consumption and facial phenotypes tested. The directions of effect estimates were compatible with the known effects of heavy alcohol exposure, but confidence intervals were largely centred around zero. We conclude that, in a sample representative of the general population, there is no strong evidence for an effect of prenatal alcohol exposure on normal-range variation in facial morphology.

Pre-pregnancy maternal obesity is associated with adverse offspring outcomes at birth and later in life. Individual studies have shown that epigenetic modifications such as DNA methylation could contribute. Within the Pregnancy and Childhood Epigenetics (PACE) Consortium, we meta-analysed the association between pre-pregnancy maternal BMI and methylation at over 450,000 sites in newborn blood DNA, across 19 cohorts (9,340 mother-newborn pairs). We attempted to infer causality by comparing effects of maternal versus paternal BMI and incorporating genetic variation. In four additional cohorts (1,817 mother-child pairs), we meta-analysed the association between maternal BMI at the start of pregnancy and blood methylation in adolescents. In newborns, maternal BMI was associated with small (<0.2% per BMI unit (1kg/m2), P<1.06*10-7) methylation variation at 9,044 sites throughout the genome. Adjustment for estimated cell proportions greatly attenuated the number of significant CpGs to 104, including 86 sites common to the unadjusted model. At 72/86 sites, the direction of association was the same in newborns and adolescents, suggesting persistence of signals. However, we found evidence for a causal intrauterine effect of maternal BMI on newborn methylation at just 8/86 sites. In conclusion, this well-powered analysis identified robust associations between maternal adiposity and variations in newborn blood DNA methylation, but these small effects may be better explained by genetic or lifestyle factors than a causal intrauterine mechanism. This highlights the need for large-scale collaborative approaches and the application of causal inference techniques in epigenetic epidemiology.

Background: Almost all species show sexual discordance in many traits and diseases. DNA methylation is known to contribute to these differences through well-established mechanisms including X-inactivation in females, imprinting and parent-of-origin effects.Sex hormones also appear to influence sexual discordance by interacting directly with the DNA methylation pathways. However, many of the population studies reporting differences in DNA methylation patterns between sexes do so as a secondary observation. More importantly, there is little agreement about the extent or strength of the discordances, or whether they change over the life course or in response to exposures. Methods: In a sample of 700 individuals from the Avon Longitudinal Study of Parents and Children, we used multi-level regression models to identify methylation differences between sexes at birth, childhood and late adolescence, and to identify changes in these differences over time. CpG sites on the sex chromosomes were excluded, along with CpGs in autosomal regions homologous with sex chromosomal regions or near common SNPs. Results: We show that autosomal sex-discordant methylation is widespread, affecting approximately 12,000 CpG sites at each time point, and stable; at least 8,500 sites are consistently different across all time points. Just over 1,000 methylation differences change from birth to late adolescence, 90% of these between birth and around age seven. Sexually discordant CpG sites are enriched in genomic loci containing androgen but not estrogen targets and in genes involved in tissue development but not housekeeping functions. There are large overlaps with sex-discordant loci in both fetal and adult brain cortex. Variance at these sites tends to be greater in males than in females. A methylation-derived sex score capturing the variance was calculated at each time point and found to be highly correlated between time points, with higher correlation in females than in males. This score is nominally associated with sex hormone levels in childhood as well as some phenotypes previously linked to sex hormone levels. Conclusions: These findings suggest that sex- discordant autosomal DNA methylation is widespread throughout the genome, likely due to the first androgen exposures in utero. It is then stably maintained from birth to late adolescence despite dramatically increased sexual dimorphism in the levels of the very same hormones. Methylation variation at sex-discordant sites within the sexes, as summarized by the methylation sex score, likely reflects in utero androgen exposure which is relevant to human health.

The human face represents a combined set of highly heritable phenotypes, but knowledge on its genetic architecture remains limited despite the relevance for various fields of science and application. A series of genome-wide association studies on 78 facial shape phenotypes quantified from 3-dimensional facial images of 10,115 Europeans identified 24 genetic loci reaching genome-wide significant association, among which 17 were previously unreported. A multi-ethnic study in additional 7,917 individuals confirmed 13 loci including 8 unreported ones. A global map of polygenic face scores assembled facial features in major continental groups consistent with anthropological knowledge. Analyses of epigenomic datasets from cranial neural crest cells revealed abundant cis-regulatory activities at the face-associated genetic loci. Luciferase reporter assays in neural crest progenitor cells highlighted enhancer activities of several face-associated DNA variants. These results substantially advance our understanding of the genetic basis underlying human facial variation and provide candidates for future in-vivo functional studies.

Background: There is evidence that different subtypes of orofacial cleft have distinct aetiologies, although the precise molecular mechanisms underlying these are unknown. Given the key role of epigenetic processes such as DNA methylation in embryonic development, it is likely that aberrant DNA methylation may also play a part in the development of orofacial clefts. Methods: In this study, we explored whether blood samples from children with different cleft subtypes showed distinct DNA methylation profiles. In whole blood samples from 150 children from the Cleft Collective cohort study, we measured DNA methylation at over 450,000 sites on the genome. We then carried out epigenome-wide association studies (EWAS) to test the association between methylation at each site and cleft subtype (cleft lip only CLO n=50; cleft palate only CPO n=50; cleft lip and palate CLP n=50). Results: We found four genomic regions differentially methylated in CLO compared to CLP, 17 in CPO compared to CLP and 294 in CPO compared to CLO. These regions included several mapping to genes that have previously been implicated in the development of orofacial clefts (for example, TBX1, COL11A2, HOXA2, PDGFRA) and over 250 novel associations. Conclusion: Our finding of distinct methylation profiles in different cleft subtypes might reflect differences in their aetiologies, with DNA methylation either playing a causal role in development of OFC subtypes or reflecting causal genetic or environmental factors. Key words: Cleft Collective, DNA methylation, epigenome-wide association study, EWAS, cleft lip, cleft palate, orofacial clefts

Asthma heritability has only been partially explained by genetic variants and is known to be sensitive to environmental factors, implicating epigenetic modifications such as DNA methylation in its pathogenesis. Using data collected in the Avon Longitudinal Study of Parents and Children (ALSPAC), we assessed associations of asthma and wheeze with DNA methylation at 7.5 years and 16.5 years, at over 450,000 CpG sites in DNA from the peripheral blood of approx. 1000 participants. We used Mendelian randomization (MR), a method of causal inference that uses genetic variants as instrumental variables, to infer the direction of association between DNA methylation and asthma. We identified 302 CpGs associated with current asthma status (FDR-adjusted P-value <0.05) and 445 with current wheeze status at 7.5 years, with substantial overlap between the two. Genes annotated to the 302 associated CpGs were enriched for pathways related to movement of cellular/subcellular components, locomotion, interleukin-4 production and eosinophil migration. All associations attenuated when adjusted for eosinophil and neutrophil cell count estimates. At 16.5 years, two sites were associated with current asthma after adjustment for cell counts. The CpGs mapped to the AP2A2 and IL5RA genes, with a -2.32 [95% CI -1.47,-3.18] and -2.49 [95% CI -1.56,-3.43] change in percentage methylation in asthma cases respectively. Two-sample bi-directional MR indicated a causal effect of asthma on DNA methylation at several CpG sites at 7.5 years. However, associations did not persist after adjustment for multiple testing. There was no evidence of a causal effect of asthma on DNA methylation at either of the two CpG sites at 16.5 years. The majority of observed associations are driven by higher eosinophil cell counts in asthma cases, acting as an intermediate phenotype, with important implications for future studies of DNA methylation in atopic diseases.