We show that a citizen science, self-selected cohort shipping samples through the mail at room temperature recaptures many known microbiome results from clinically collected cohorts and reveals new ones. Of particular interest is integrating n = 1 study data with the population data, showing that the extent of microbiome change after events such as surgery can exceed differences between distinct environmental biomes, and the effect of diverse plants in the diet, which we confirm with untargeted metabolomics on hundreds of samples.

Immediate freezing at -20°C or below has been considered the gold standard for microbiome preservation, yet this approach is not feasible for many field studies, ranging from anthropology to wildlife conservation. Here we tested five methods for preserving human and dog fecal specimens for periods of up to 8 weeks, including such types of variation as freeze-thaw cycles and the high temperature fluctuations often encountered under field conditions. We found that three of the methods-95% ethanol, FTA cards, and the OMNIgene Gut kit-can preserve samples sufficiently well at ambient temperatures such that differences at 8 weeks are comparable to differences among technical replicates. However, even the worst methods, including those with no fixative, were able to reveal microbiome differences between species at 8 weeks and between individuals after a week, allowing meta-analyses of samples collected using various methods when the effect of interest is expected to be larger than interindividual variation (although use of a single method within a study is strongly recommended to reduce batch effects). Encouragingly for FTA cards, the differences caused by this method are systematic and can be detrended. As in other studies, we strongly caution against the use of 70% ethanol. The results, spanning 15 individuals and over 1,200 samples, provide our most comprehensive view to date of storage effects on stool and provide a paradigm for the future studies of other sample types that will be required to provide a global view of microbial diversity and its interaction among humans, animals, and the environment. IMPORTANCE Our study, spanning 15 individuals and over 1,200 samples, provides our most comprehensive view to date of storage and stabilization effects on stool. We tested five methods for preserving human and dog fecal specimens for periods of up to 8 weeks, including the types of variation often encountered under field conditions, such as freeze-thaw cycles and high temperature fluctuations. We show that several cost-effective methods provide excellent microbiome stability out to 8 weeks, opening up a range of field studies with humans and wildlife that would otherwise be cost-prohibitive.

Decomposition spawns a microbial zoo The death of a large animal represents a food bonanza for microorganisms. Metcalf et al. monitored microbial activity during the decomposition of mouse and human cadavers. Regardless of soil type, season, or species, the microbial succession during decomposition was a predictable measure of time since death. An overlying corpse leaches nutrients that allow soil- and insect-associated fungi and bacteria to grow. These microorganisms are metabolic specialists that convert proteins and lipids into foul-smelling compounds such as cadaverine, putrescine, and ammonia, whose signature may persist in the soil long after a corpse has been removed. Science , this issue p. 158

A mosaic of cross-phylum chemical interactions occurs between all metazoans and their microbiomes. A number of molecular families that are known to be produced by the microbiome have a marked effect on the balance between health and disease1–9. Considering the diversity of the human microbiome (which numbers over 40,000 operational taxonomic units10), the effect of the microbiome on the chemistry of an entire animal remains underexplored. Here we use mass spectrometry informatics and data visualization approaches11–13 to provide an assessment of the effects of the microbiome on the chemistry of an entire mammal by comparing metabolomics data from germ-free and specific-pathogen-free mice. We found that the microbiota affects the chemistry of all organs. This included the amino acid conjugations of host bile acids that were used to produce phenylalanocholic acid, tyrosocholic acid and leucocholic acid, which have not previously been characterized despite extensive research on bile-acid chemistry14. These bile-acid conjugates were also found in humans, and were enriched in patients with inflammatory bowel disease or cystic fibrosis. These compounds agonized the farnesoid X receptor in vitro, and mice gavaged with the compounds showed reduced expression of bile-acid synthesis genes in vivo. Further studies are required to confirm whether these compounds have a physiological role in the host, and whether they contribute to gut diseases that are associated with microbiome dysbiosis. Metabolomics data from germ-free and specific-pathogen-free mice reveal effects of the microbiome on host chemistry, identifying conjugations of bile acids that are also enriched in patients with inflammatory bowel disease or cystic fibrosis.

Abstract Although much work has linked the human microbiome to specific phenotypes and lifestyle variables, data from different projects have been challenging to integrate and the extent of microbial and molecular diversity in human stool remains unknown. Using standardized protocols from the Earth Microbiome Project and sample contributions from over 10,000 citizen-scientists, together with an open research network, we compare human microbiome specimens primarily from the USA, UK, and Australia to one another and to environmental samples. Our results show an unexpected range of beta-diversity in human stool microbiomes as compared to environmental samples, demonstrate the utility of procedures for removing the effects of overgrowth during room-temperature shipping for revealing phenotype correlations, uncover new molecules and kinds of molecular communities in the human stool metabolome, and examine emergent associations among the microbiome, metabolome, and the diversity of plants that are consumed (rather than relying on reductive categorical variables such as veganism, which have little or no explanatory power). We also demonstrate the utility of the living data resource and cross-cohort comparison to confirm existing associations between the microbiome and psychiatric illness, and to reveal the extent of microbiome change within one individual during surgery, providing a paradigm for open microbiome research and education. Importance We show that a citizen-science, self-selected cohort shipping samples through the mail at room temperature recaptures many known microbiome results from clinically collected cohorts and reveals new ones. Of particular interest is integrating n=1 study data with the population data, showing that the extent of microbiome change after events such as surgery can exceed differences between distinct environmental biomes, and the effect of diverse plants in the diet which we confirm with untargeted metabolomics on hundreds of samples.

Abstract Long-range sequencing information is required for haplotype phasing, de novo assembly and structural variation detection. Current long-read sequencing technologies can provide valuable long-range information but at a high cost with low accuracy and high DNA input requirement. We have developed a single-tube Transposase Enzyme Linked Long-read Sequencing (TELL-Seq ™ ) technology, which enables a low-cost, high-accuracy and high-throughput short-read next generation sequencer to routinely generate over 100 Kb long-range sequencing information with as little as 0.1 ng input material. In a PCR tube, millions of clonally barcoded beads are used to uniquely barcode long DNA molecules in an open bulk reaction without dilution and compartmentation. The barcode linked reads are used to successfully assemble genomes ranging from microbes to human. These linked-reads also generate mega-base-long phased blocks and provide a cost-effective tool for detecting structural variants in a genome, which are important to identify compound heterozygosity in recessive Mendelian diseases and discover genetic drivers and diagnostic biomarkers in cancers.

ABSTRACT As our understanding of the structure and diversity of the microbial world grows, interpreting its function is of critical interest for understanding and managing the many systems microbes influence. Despite advances in sequencing, lack of standardization challenges comparisons among studies that could provide insight into the structure and function of microbial communities across multiple habitats on a planetary scale. Technical variation among distinct studies without proper standardization of approaches prevents robust meta-analysis. Here, we present a multi-omics, meta-analysis of a novel, diverse set of microbial community samples collected for the Earth Microbiome Project. We include amplicon (16S, 18S, ITS) and shotgun metagenomic sequence data, and untargeted metabolomics data (liquid chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography mass spectrometry), centering our description on relationships and co-occurrences of microbially-related metabolites and microbial taxa across environments. Standardized protocols and analytical methods for characterizing microbial communities, including assessment of molecular diversity using untargeted metabolomics, facilitate identification of shared microbial and metabolite features, permitting us to explore diversity at extraordinary scale. In addition to a reference database for metagenomic and metabolomic data, we provide a framework for incorporating additional studies, enabling the expansion of existing knowledge in the form of a community resource that will become more valuable with time. To provide examples of applying this database, we outline important ecological questions that can be addressed, and test the hypotheses that every microbe and metabolite is everywhere, but the environment selects. Our results show that metabolite diversity exhibits turnover and nestedness related to both microbial communities and the environment. The relative abundances of microbially-related metabolites vary and co-occur with specific microbial consortia in a habitat-specific manner, and highlight the power of certain chemistry – in particular terpenoids – in distinguishing Earth’s environments.

Abstract Parkinson’s disease (PD) is a movement disorder characterized by neuroinflammation, α-synuclein pathology, and neurodegeneration. Most cases of PD are non-hereditary, suggesting a strong role for environmental factors, and it has been speculated that disease may originate in peripheral tissues such as the gastrointestinal (GI) tract before affecting the brain. The gut microbiome is altered in PD and may impact motor and GI symptoms as indicated by animal studies, though mechanisms of gut-brain interactions remain incompletely defined. Intestinal bacteria ferment dietary fibers into short-chain fatty acids, with fecal levels of these molecules differing between PD and healthy controls and in mouse models. Among other effects, dietary microbial metabolites can modulate activation of microglia, brain-resident immune cells implicated in PD. We therefore investigated whether a fiber-rich diet influences microglial function in α-synuclein overexpressing (ASO) mice, a preclinical model with PD-like symptoms and pathology. Feeding a prebiotic high-fiber diet attenuates motor deficits and reduces α-synuclein aggregation in the substantia nigra of mice. Concomitantly, the gut microbiome of ASO mice adopts a profile correlated with health upon prebiotic treatment, which also reduces microglial activation. Single-cell RNA-seq analysis of microglia from the substantia nigra and striatum uncovers increased pro-inflammatory signaling and reduced homeostatic responses in ASO mice compared to wild-type counterparts on standard diets. However, prebiotic feeding reverses pathogenic microglial states in ASO mice and promotes expansion of protective disease-associated macrophage (DAM) subsets of microglia. Notably, depletion of microglia using a CSF1R inhibitor eliminates the beneficial effects of prebiotics by restoring motor deficits to ASO mice despite feeding a prebiotic diet. These studies uncover a novel microglia-dependent interaction between diet and motor symptoms in mice, findings that may have implications for neuroinflammation and PD.

A mosaic of cross-phyla chemical interactions occurs between all metazoans and their microbiomes. In humans, the gut harbors the heaviest microbial load, but many organs, particularly those with a mucosal surface, associate with highly adapted and evolved microbial consortia. The microbial residents within these organ systems are increasingly well characterized, yielding a good understanding of human microbiome composition, but we have yet to elucidate the full chemical impact the microbiome exerts on an animal and the breadth of the chemical diversity it contributes. A number of molecular families are known to be shaped by the microbiome including short-chain fatty acids, indoles, aromatic amino acid metabolites, complex polysaccharides, and host lipids; such as sphingolipids and bile acids. These metabolites profoundly affect host physiology and are being explored for their roles in both health and disease. Considering the diversity of the human microbiome, numbering over 40,000 operational taxonomic units, a plethora of molecular diversity remains to be discovered. Here, we use unique mass spectrometry informatics approaches and data mapping onto a murine 3D-model to provide an untargeted assessment of the chemical diversity between germ-free (GF) and colonized mice (specific-pathogen free, SPF), and report the finding of novel bile acids produced by the microbiome in both mice and humans that have evaded characterization despite 170 years of research on bile acid chemistry.

Microbial sequences inferred as belonging to one sample may not have originated from that sample. Such contamination may arise from laboratory or reagent sources or from physical exchange between samples. This study seeks to rigorously assess the behavior of this often-neglected between-sample contamination. Using unique bacteria each assigned a particular well in a plate, we assess the frequency at which sequences from each source appears in other wells. We evaluate the effects of different DNA extraction methods performed in two labs using a consistent plate layout including blanks, low biomass, and high biomass samples. Well-to-well contamination occurred primarily during DNA extraction, and to a lesser extent in library preparation, while barcode leakage was negligible. Labs differed in the levels of contamination. DNA extraction methods differed in their occurrences and levels of well-to-well contamination, with robotic methods having more well-to-well contamination while manual methods having higher background contaminants. Well-to-well contamination was observed to occur primarily in neighboring samples, with rare events up to 10 wells apart. The effect of well-to-well was greatest in samples with lower biomass, and negatively impacted metrics of alpha and beta diversity. Our work emphasizes that sample contamination is a combination of crosstalk from nearby wells and background contaminants. To reduce well-to-well effects, samples should be randomized across plates, and samples of similar biomass processed together. Researchers should evaluate well-to-well contamination in study design and avoid removal of taxa or OTUs appearing in negative controls, as many will be microbes from other samples rather than reagent contaminants.