The microtubule motors kinesin and dynein function collectively to drive vesicular transport. High-resolution tracking of vesicle motility in the cell indicates that transport is often bidirectional, characterized by frequent directional changes. However, the mechanisms coordinating the collective activities of oppositely oriented motors bound to the same cargo are not well understood. To examine motor coordination, we purified neuronal transport vesicles and analyzed their motility via automated particle tracking with nanometer resolution. The motility of purified vesicles reconstituted in vitro closely models the movement of LysoTracker-positive vesicles in primary neurons, where processive bidirectional motility is interrupted with frequent directional switches, diffusional movement, and pauses. Quantitative analysis indicates that vesicles copurify with a low number of stably bound motors: one to five dynein and one to four kinesin motors. These observations compare well to predictions from a stochastic tug-of-war model, where transport is driven by the force-dependent kinetics of teams of opposing motors in the absence of external regulation. Together, these observations indicate that vesicles move robustly with a small complement of tightly bound motors and suggest an efficient regulatory scheme for bidirectional motility where small changes in the number of engaged motors manifest in large changes in the motility of cargo.

Abstract Cells precisely control their mechanical properties to organize and differentiate into tissues. The architecture and connectivity of cytoskeletal filaments changes in response to mechanical and biochemical cues, allowing the cell to rapidly tune its mechanics from highly-crosslinked, elastic networks to weakly-crosslinked viscous networks. While the role of actin crosslinking in controlling actin network mechanics is well-characterized in purified actin networks, its mechanical role in the cytoplasm of living cells remains unknown. Here, we probe the frequency-dependent intracellular viscoelastic properties of living cells using multifrequency excitation and in situ optical trap calibration. At long timescales in the intracellular environment, we observe that the cytoskeleton becomes fluid-like. The mechanics are well-captured by a model in which actin filaments are dynamically connected by a single dominant crosslinker. A disease-causing point mutation (K255E) of the actin crosslinker α-actinin 4 (ACTN4) causes its binding kinetics to be insensitive to tension. Under normal conditions, the viscoelastic properties of wild type (WT) and K255E+/- cells are similar. However, when tension is reduced through myosin II inhibition, WT cells relax 3x faster to the fluid-like regime while K255E+/- cells are not affected. These results indicate that dynamic actin crosslinking enables the cytoplasm to flow at long timescales.

Summary The misregulation of tau, a neuronal microtubule-associated protein, is linked to defective axonal transport and neurodegenerative disease. We reconstituted the motility of isolated phagosomes along microtubules to ask how the sets of motors transporting a cargo determine its motility and response to tau. Using quantitative photobleaching, we find that early phagosomes (EPs) and late phagosomes (LPs) are associated with different sets of kinesin-1, -2, -3, and dynein. While EPs exhibit unidirectional retrograde transport, LPs move bidirectionally. Previously, we found that tau biases LP transport towards the microtubule minus-end. Here, we find that tau strongly inhibits long-range retrograde EP motility. Tau impedes the forces generated by multi-dynein teams and accelerates dynein unbinding under load. Thus, specific cargoes differentially respond to tau, where dynein-complexes on EPs are more sensitive to tau than those on LPs.

Abstract The conserved kinesin-5 bipolar tetrameric motors slide apart microtubules during mitotic spindle assembly and elongation. Kinesin-5 bipolar organization originates from its conserved tetrameric helical minifilament, which position the C-terminal tail domains of two subunits near the N-terminal motor domains of two anti-parallel subunits (Scholey et al, 2014). This unique tetrameric structure enables kinesin-5 to simultaneously engage two microtubules and transmit forces between them, and for multiple kinesin-5 motors to organize via tail to motor interactions during microtubule sliding (Bodrug et al, 2020). Here, we show how these two structural adaptations, the kinesin-5 tail-motor domain interactions and the length of the tetrameric minifilament, determine critical aspects of kinesin-5 motility and sliding mechanisms. An x-ray structure of the 34-nm kinesin-5 minifilament reveals how the dual dimeric N-terminal coiled-coils emerge from the tetrameric central bundle. Using this structure, we generated active bipolar mini-tetrameric motors from Drosophila and human orthologs, which are half the length of native kinesin-5. Using single-molecule motility assays, we show that kinesin-5 tail domains promote mini-tetramers static pauses that punctuate processive motility. During such pauses, kinesin-5 mini-tetramers form multi-motor clusters mediated via tail to motor domain cross-interactions. These clusters undergo slow and highly processive motility and accumulate at microtubule plus-ends. In contrast to native kinesin-5, mini-tetramers require tail domains to initiate microtubule crosslinking. Although mini-tetramers are highly strained in initially aligning microtubules, they slide microtubules more efficiently than native kinesin-5, due to their decreased minifilament flexibility. Our studies reveal that the conserved kinesin-5 motor-tail mediated clustering and the length of the tetrameric minifilament are key features for sliding motility and are critical in organizing microtubules during mitotic spindle assembly and elongation.

Abstract Microtubule-associated proteins (MAPs) modulate the motility of kinesin and dynein along microtubules to control the transport of vesicles and organelles. The neuronal MAP tau inhibits kinesin-dependent transport. Phosphorylation of tau at tyrosine 18 by fyn kinase results in weakened inhibition of kinesin-1. We examined the motility of early endosomes and lysosomes in cells expressing wild-type (WT) tau and phosphomimetic Y18E tau. Lysosome motility is strongly inhibited by tau. Y18E tau preferentially inhibits lysosomes in the cell periphery, while centrally located lysosomes are less affected. Early endosomes are more sensitive to tau than lysosomes, and are inhibited by both WT and Y18E tau. Our results show that different cargoes have disparate responses to tau, likely governed by the types of kinesin motors driving their transport. In support of this model, kinesin-1 and -3 are strongly inhibited by tau while kinesin-2 and dynein are less affected. In contrast to kinesin-1, we find that kinesin-3 is strongly inhibited by phosphorylated tau.

Summary Huntington’s disease (HD) is caused by polyglutamine (polyQ) expansions in huntingtin (HTT). Polyglutamine repeat lengths >35Q lead to neurodegeneration and longer repeats correspond to earlier symptom onset. HTT scaffolds kinesin-1 and dynein to a variety of vesicles and organelles directly and through adaptors. To characterize the effects of HTT polyQ expansions on axonal transport, we tracked BDNF vesicles, mitochondria, and lysosomes in neurons induced from an isogenic set of human stem cell lines with repeat lengths of 30, 45, 65, and 81Q. Mild and intermediate pathogenic polyQ expansions caused increased BDNF motility, while HTT-81Q misdirected BDNF towards the distal tip. In comparison, mitochondria and lysosome transport showed mild defects with polyQHTT. We next examined the effect of polyQHTT in combination with neuroinflammatory stress. Under stress, BDNF cargoes in HTT-30Q neurons were more processive. Stress in HTT-81Q resulted in a stark decrease in the number of BDNF cargoes. However, the few remaining BDNF cargoes displayed more frequent long-range motility in both directions. Under neuroinflammatory stress, lysosomes were more abundant in HTT-81Q neurons, and motile lysosomes moved less processively and had an anterograde bias while lysosomes in HTT-30Q where not strongly affected. To examine how HTT-polyQ expansions altered the motors and adaptors on vesicular cargoes, we isolated BDNF cargoes from neurons and quantified the proteins associated with them. BDNF-endosomes isolated from HTT-81Q neurons associated with 2.5 kinesin-1 and 3.9 HAP1 molecules on average, compared to 1.0 kinesin-1 and 1.0 HAP1 molecule for HTT-30Q neurons. Together, these results show that polyQ expansions in HTT cause aberrant motor and adaptor recruitment to cargoes, resulting in dysregulated transport and responses to neuroinflammatory stress.

Doublecortin (DCX) is a neuronal microtubule-associated protein (MAP) that binds directly to microtubules via two Doublecortin (DC) domains. The DC domains sense the nucleotide state, longitudinal curvature, and protofilament number of the microtubule lattice, indicating a role in the regulation of microtubule structure in neurons. Mutations in DCX cause lissencephaly and subcortical band heterotopia (also known as double-cortex syndrome) due to impaired neuronal migration. To better understand the role of DCX in neuronal migration, we developed a model system based on induced pluripotent stem cells (iPSCs). We used CRISPR/Cas9 to knock out the Dcx gene in iPSCs and differentiated the cells into cortical neurons. Compared to control neurons, the DCX-KO neurons showed reduced velocities of nuclear movements. The reduced velocities correlated with an increase in the number of neurites early in the neuronal development process, consistent with a neuronal migration phenotype and previous findings in a DCX-KO mouse model. Neurite branching is regulated by a host of MAPs and other factors, as well as by microtubule polymerization dynamics. However, microtubule dynamics were unchanged in DCX-KO neurons, with similar growth rates, lifetimes, and numbers. Rather, we observe a significant reduction in tubulin polyglutamylation in DCX-KO neurons. Polyglutamylation is usually abundant in neurons and regulates microtubule severing enzymes and intracellular trafficking by molecular motors. Consistently, we observe that lysosomes in DCX-KO neurons show a reduction of their processivity. We propose that the reduction of polyglutamylation leads to increased neurite branching and thus reduced neuronal migration. Our results indicate an unexpected role for DCX in the homeostasis of the tubulin code.

Abstract The microtubule-associated protein (MAP) Tau is an intrinsically disordered protein (IDP) primarily expressed in axons, where it functions to regulate microtubule dynamics, modulate motor protein motility, and participate in signaling cascades. Tau misregulation and point mutations are linked to neurodegenerative diseases, including Progressive Supranuclear Palsy (PSP), Pick’s Disease and Alzheimer’s disease. Many disease-associated mutations in Tau occur in the C-terminal microtubule-binding domain of the protein. Effects of C-terminal mutations in Tau have led to the widely accepted disease-state theory that missense mutations in Tau reduce microtubule-binding affinity or increase Tau propensity to aggregate. Here, we investigate the effect of an N-terminal disease-associated mutation in Tau, R5L, on Tau-microtubule interactions using an in vitro reconstituted system. Contrary to the canonical disease-state theory, we determine the R5L mutation does not reduce Tau affinity for the microtubule using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. Rather, the R5L mutation decreases the ability of Tau to form larger order complexes, or Tau patches, at high concentrations of Tau. Using Nuclear Magnetic Resonance (NMR), we show that the R5L mutation results in a local structural change that reduces interactions of the projection domain in the presence of microtubules. Altogether, these results challenge both the current paradigm of how mutations in Tau lead to disease and the role of the projection domain in modulating Tau behavior on the microtubule surface. Significance Statement The microtubule-associated protein Tau is strongly linked to a number of neurological diseases. Disease onset is typically associated with weakened interaction with the microtubule, but this widely accepted model is based on hyperphosphorylation or mutations within the C-terminal microtubule-binding domain of Tau. Here, we find an N-terminal disease-associated mutation in Tau, R5L, does not reduce Tau affinity for microtubules, but instead modifies the N-terminal structure, altering Tau’s behavior and ability to condense on the microtubule surface. Our findings challenge the current paradigms of both how mutations in Tau lead to disease and the functional role of the N-terminal region of Tau.

Microtubules in neurons can be characterized based on their dynamic behavior (dynamic vs. stable), on their point of origin (centrosomal vs. acentrosomal), on their relative orientation (parallel vs. antiparallel), and a range of other features. Patterns of different microtubule types are essential in neurite extension and neuronal migration. Cellular model systems such as rodent primary cultures and iPSC-derived neurons have provided key insights into how these patterns are created and maintained through the action of microtubule associated proteins (MAPs), motor proteins, and regulatory enzymes. Here we have characterized a recent cellular model based on induced pluripotent stem cells (iPSC)-derived neurons (EBiSC-NEUR1 neurons), in which doxycycline-induced expression of Neurogenin-2 drives consistent trans-differentiation into the neuronal state. We measured the process extension and nucleokinesis of NEUR1 neurons, which are comparable to published data from primary cultures and other iPSC-based models. We challenged NEUR1 neurons with a panel of drugs modifying microtubule physiology. NEUR1 extension and nucleokinesis were significantly perturbed by two microtubule-targeting drugs, namely a taxane (paclitaxel) and a vinca alkaloid (DZ-2384). In contrast, inhibition of microtubule severing (spastazoline) or of deacetylation (trichostatin A) had a limited effect on nucleokinesis only. Our results support the primary importance of microtubule dynamics in neuronal development and demonstrate the power of NEUR1 neurons as a model system.

Organelles, proteins, and mRNA are transported bidirectionally along microtubules by plus-end directed kinesin and minus-end directed dynein motors. Microtubules are decorated by microtubule-associated proteins (MAPs) that organize the cytoskeleton, regulate microtubule dynamics and modulate the interaction between motor proteins and microtubules to direct intracellular transport. Tau is a neuronal MAP that stabilizes axonal microtubules and crosslinks them into bundles. Dysregulation of tau leads to a range of neurodegenerative diseases known as tauopathies including Alzheimer's disease (AD). Tau reduces the processivity of kinesin and dynein by acting as an obstacle on the microtubule. Single-molecule assays indicate that kinesin-1 is more strongly inhibited than kinesin-2 or dynein, suggesting tau might act to spatially modulate the activity of specific motors. To investigate the role of tau in regulating bidirectional transport, we isolated phagosomes driven by kinesin-1, kinesin-2, and dynein and reconstituted their motility along microtubules. We find that tau biases bidirectional motility towards the microtubule minus-end in a dose-dependent manner. Optical trapping measurements show that tau increases the magnitude and frequency of forces exerted by dynein through inhibiting opposing kinesin motors. Mathematical modeling indicates that tau controls the directional bias of intracellular cargoes through differentially tuning the processivity of kinesin-1, kinesin-2, and dynein. Taken together, these results demonstrate that tau modulates motility in a motor-specific manner to direct intracellular transport, and suggests that dysregulation of tau might contribute to neurodegeneration by disrupting the balance of plus- and minus-end directed transport.