Critical developmental control genes sometimes contain “shadow” enhancers that can be located in remote positions, including the introns of neighboring genes [1Hong J.W. Hendrix D.A. Levine M.S. Shadow enhancers as a source of evolutionary novelty.Science. 2008; 321: 1314Crossref PubMed Scopus (321) Google Scholar]. They nonetheless produce patterns of gene expression that are the same as or similar to those produced by more proximal primary enhancers. It was suggested that shadow enhancers help foster robustness in gene expression in response to environmental or genetic perturbations [2Boettiger A.N. Levine M. Synchronous and stochastic patterns of gene activation in the Drosophila embryo.Science. 2009; 325: 471-473Crossref PubMed Scopus (193) Google Scholar, 3Perry M.W. Cande J.D. Boettiger A.N. Levine M. Evolution of insect dorsoventral patterning mechanisms.Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2009; 74: 275-279Crossref PubMed Scopus (16) Google Scholar]. We critically tested this hypothesis by employing a combination of bacterial artificial chromosome (BAC) recombineering and quantitative confocal imaging methods [2Boettiger A.N. Levine M. Synchronous and stochastic patterns of gene activation in the Drosophila embryo.Science. 2009; 325: 471-473Crossref PubMed Scopus (193) Google Scholar, 4Venken K.J. He Y. Hoskins R.A. Bellen H.J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.Science. 2006; 314: 1747-1751Crossref PubMed Scopus (578) Google Scholar]. Evidence is presented that the snail gene is regulated by a distal shadow enhancer located within a neighboring locus. Removal of the proximal primary enhancer does not significantly perturb snail function, including the repression of neurogenic genes and formation of the ventral furrow during gastrulation at normal temperatures. However, at elevated temperatures, there is sporadic loss of snail expression and coincident disruptions in gastrulation. Similar defects are observed at normal temperatures upon reductions in the levels of Dorsal, a key activator of snail expression (reviewed in [5Hong J.W. Hendrix D.A. Papatsenko D. Levine M.S. How the Dorsal gradient works: Insights from postgenome technologies.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 20072-20076Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar]). These results suggest that shadow enhancers represent a novel mechanism of canalization whereby complex developmental processes “bring about one definite end-result regardless of minor variations in conditions” [6Waddington C.H. Canalization of development and the inheritance of acquired characters.Nature. 1942; 150: 563-565Crossref Scopus (2002) Google Scholar].

Abstract Engineered reproductive species barriers are useful for impeding gene flow and driving desirable genes into wild populations in a reversible threshold-dependent manner. However, methods to generate synthetic barriers are lacking in advanced eukaryotes. To overcome this challenge, we engineered SPECIES ( S ynthetic P ostzygotic barriers E xploiting C RISPR-based I ncompatibilities for E ngineering S pecies) to generate postzygotic reproductive barriers. Using this approach, we engineer multiple reproductively isolated SPECIES and demonstrate their threshold-dependent gene drive capabilities in D. melanogaster . Given the near-universal functionality of CRISPR tools, this approach should be portable to many species, including insect disease vectors in which confinable gene drives could be of great practical utility. One Sentence Summary Synthetically engineered SPECIES drive confinable population replacement.

Abstract Butterfly color patterns provide visible and biodiverse phenotypic readouts of the patterning processes that occur in a developing epithelium. While the secreted ligand WntA was shown to instruct the color pattern formation in butterflies, its modes of reception and signal transduction remain elusive. Butterfly genomes encode four homologues of the Frizzled-family of Wnt receptors. Here we show that CRISPR mosaic knock-outs of frizzled2 ( fz2 ) phenocopy the color pattern effects of WntA loss-of-function in multiple nymphalids. While WntA mosaic clones result in intermediate patterns of reduced size, consistently with a morphogen function, fz2 clones are cell-autonomous. Shifts in pupal expression in WntA crispants show that WntA and fz2 are under positive and negative feedback, respectively. Fz1 is required for Wnt-independent planar cell polarity (PCP) in the wing epithelium. Fz3 and Fz4 show phenotypes consistent with Wnt competitive-antagonist functions in vein formation (Fz3 and Fz4), wing margin specification (Fz3), and color patterning in the Discalis and Marginal Band Systems (Fz4). Overall, these data show that the WntA/Frizzled2 morphogen-receptor pair forms a signaling axis that instructs butterfly color patterning, and shed light on the functional diversity of insect Frizzled receptors.

Hemipterans include some of the most important insect pests of agricultural systems and vectors of plant pathogens. The vector, Diaphorina citri (Asian citrus psyllid) belonging to the Psylloidae superfamily, is the primary target of approaches to stop the spread of the pathogen Ca. Liberibacter asiaticus that causes Huanglongbing or citrus greening disease. High quality genomic resources enable rapid functional discovery that can target disease transmission and control. The previous psyllid genome (Diaci v1.1) available in NCBI is missing 25% of the single copy markers conserved in other Hemipterans. Manual genome curation helped to identify a significant number of genome anomalies including misassemblies and missing genes. We present an improved and highly contiguous de novo assembly based on PacBio long reads followed by Dovetail Chicago and Hi-C based scaffolding. The current assembly (Diaci v3) has 13 chromosomal length scaffolds with a genome size of 475 Mb. This is the first report of a chromosomal length assembly in the Hemiptera order according to our knowledge. Full-length cDNA transcripts were sequenced with PacBio Iso-Seq technology from diseased and healthy tissue at multiple life stages. Iso-Seq along with diverse Illumina RNAseq expression data were used to predict 19,049 protein-coding genes in psyllid using MAKER annotation pipeline. We also generated a genome independent transcriptome with a comprehensive catalog of all genes in the psyllid. Gene-targeting technologies like RNAi, antisense oligos and CRISPR require accurate annotation of genes. Lack of closely related and well characterized model organisms coupled with the diversity of insect genomes impacts the quality of predicted gene models. We used the improved genomic resources to create a high-quality manually curated gene set for developmental, structural and immune pathways. All resources are available on https://citrusgreening.org/, a portal for all omics resources for the citrus greening disease research community. The high quality ACP genome assembly, annotation based on transcriptomics evidence, manual curation of critical pathways and a genome independent de novo transcriptome will provide a foundation for comparative analysis among genomes of agricultural pests and vectors in the Hemiptera.

Abstract In Heliconius butterflies, wing pattern diversity is controlled by a few genes of large effect that regulate colour pattern switches between morphs and species across a large mimetic radiation. One of these genes, cortex , has been repeatedly associated with colour pattern evolution in butterflies. Here we carried out CRISPR knock-outs in multiple Heliconius species and show that cortex is a major determinant of scale cell identity. Chromatin accessibility profiling and introgression scans identified cis -regulatory regions associated with discrete phenotypic switches. CRISPR perturbation of these regions in black hindwing genotypes recreated a yellow bar, revealing their spatially limited activity. In the H. melpomene/timareta lineage, the candidate CRE from yellow-barred phenotype morphs is interrupted by a transposable element, suggesting that cis -regulatory structural variation underlies these mimetic adaptations. Our work shows that cortex functionally controls scale colour fate and that its cis -regulatory regions control a phenotypic switch in a modular and pattern-specific fashion.

Abstract As a major insect vector of multiple arboviruses, Aedes aegypti poses a significant global health and economic burden. A number of genetic engineering tools have been exploited to understand its biology with the goal of reducing its impact. For example, current tools have focused on knocking-down RNA transcripts, inducing loss-of-function mutations or expressing exogenous DNA. However, methods for transactivating endogenous genes have not been developed. To fill this void, here we developed a CRISPR activation (CRISPRa) system in Ae. aegypti to transactivate target gene expression. Gene expression is activated through pairing a catalytically-inactive (‘dead’) Cas9 (dCas9) with a highly-active tripartite activator, VP64-p65-Rta (VPR) and synthetic guide RNA (sgRNA) complementary to a user defined target-gene promoter region. As a proof of concept, we demonstrate that engineered Ae. aegypti mosquitoes harboring a binary CRISPRa system can be used to effectively overexpress two developmental genes, even-skipped (eve) and hedgehog (hh) , resulting in observable morphological phenotypes. We also used this system to overexpress the positive transcriptional regulator of the Toll immune pathway known as AaRel1 , which resulted in a significant suppression of dengue virus serotype 2 (DENV2). This system provides a versatile tool for research pathways not previously possible in Ae. aegypti , such as programmed overexpression of endogenous genes, and may lead to the development of innovative vector control tools.

Despite the variety, prominence, and adaptive significance of butterfly wing patterns surprisingly little known about the genetic basis of wing color diversity. Even though there is intense interest in wing pattern evolution and development, the technical challenge of genetically manipulating butterflies has slowed efforts to functionally characterize color pattern development genes. To identify candidate wing pigmentation genes we used RNA-seq to characterize transcription across multiple stages of butterfly wing development, and between different color pattern elements, in the painted lady butterfly Vanessa cardui. This allowed us to pinpoint genes specifically associated with red and black pigment patterns. To test the functions of a subset of genes associated with presumptive melanin pigmentation we used CRISPR/Cas9 genome editing in four different butterfly genera. pale, Ddc, and yellow knockouts displayed reduction of melanin pigmentation, consistent with previous findings in other insects. Interestingly, however, yellow-d, ebony, and black knockouts revealed that these genes have localized effects on tuning the color of red, brown, and ochre pattern elements. These results point to previously undescribed mechanisms for modulating the color of specific wing pattern elements in butterflies, and provide an expanded portrait of the insect melanin pathway.

Tradeoffs affect resource allocation during development and result in fitness consequences that drive the evolution of life history strategies. Yet despite their importance, we know little about the mechanisms underlying life history tradeoffs in wild populations. Many species of Colias butterflies exhibit an alternative life history strategy (ALHS) where females divert resources from wing pigment synthesis to reproductive and somatic development. Due to this reallocation, a wing color polymorphism is associated with the ALHS: individuals have either yellow/orange or white wings. Here we map the genetic basis of the ALHS switch in Colias crocea to a transposable element insertion downstream of the Colias homolog of BarH-1 , a homeobox transcription factor. Using CRISPR/Cas9 gene editing, antibody staining, and electron microscopy we find morph-specific specific expression of BarH-1 suppresses the formation of pigment granules in wing scales. Lipid and transcriptome analyses reveal physiological differences associated with the ALHS. These findings characterize a novel mechanism for a female-limited ALHS and show that the switch arises via recruitment of a transcription factor previously known for its function in cell fate determination in pigment cells of the retina.