Sample multiplexing facilitates scRNA-seq by reducing costs and identifying artifacts such as cell doublets. However, universal and scalable sample barcoding strategies have not been described. We therefore developed MULTI-seq: multiplexing using lipid-tagged indices for single-cell and single-nucleus RNA sequencing. MULTI-seq reagents can barcode any cell type or nucleus from any species with an accessible plasma membrane. The method involves minimal sample processing, thereby preserving cell viability and endogenous gene expression patterns. When cells are classified into sample groups using MULTI-seq barcode abundances, data quality is improved through doublet identification and recovery of cells with low RNA content that would otherwise be discarded by standard quality-control workflows. We use MULTI-seq to track the dynamics of T-cell activation, perform a 96-plex perturbation experiment with primary human mammary epithelial cells and multiplex cryopreserved tumors and metastatic sites isolated from a patient-derived xenograft mouse model of triple-negative breast cancer. Tagging live single cells and nuclei with lipid- or cholesterol-modified oligonucleotides enables massive scRNA-seq sample multiplexing, identifies doublets and recovers cells with low RNA content.

Abstract The human breast undergoes lifelong remodeling in response to estrogen and progesterone, but hormone exposure also increases breast cancer risk. Here, we use single-cell analysis to identify distinct mechanisms through which breast composition and cell state affect hormone signaling. We show that prior pregnancy reduces the transcriptional response of hormone-responsive (HR+) epithelial cells, whereas high body mass index (BMI) reduces overall HR+ cell proportions. These distinct changes both impact neighboring cells by effectively reducing the magnitude of paracrine signals originating from HR+ cells. Because pregnancy and high BMI are known to protect against hormone-dependent breast cancer in premenopausal women, our findings directly link breast cancer risk with person-to-person heterogeneity in hormone responsiveness. More broadly, our findings illustrate how cell proportions and cell state can collectively impact cell communities through the action of cell-to-cell signaling networks.

Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) using droplet microfluidics occasionally produces transcriptome data representing more than one cell. These technical artifacts are caused by cell doublets formed during cell capture and occur at a frequency proportional to the total number of sequenced cells. The presence of doublets can lead to spurious biological conclusions, which justifies the practice of sequencing fewer cells to limit doublet formation rates. Here, we present a computational doublet detection tool - DoubletFinder - that identifies doublets based solely on gene expression features. DoubletFinder infers the putative gene expression profile of real doublets by generating artificial doublets from existing scRNA-seq data. Neighborhood detection in gene expression space then identifies sequenced cells with increased probability of being doublets based on their proximity to artificial doublets. DoubletFinder robustly identifies doublets across scRNA-seq datasets with variable numbers of cells and sequencing depth, and predicts false-negative and false-positive doublets defined using conventional barcoding approaches. We anticipate that DoubletFinder will aid in scRNA-seq data analysis and will increase the throughput and accuracy of scRNA-seq experiments.

We describe MULTI-seq: A rapid, modular, and universal scRNA-seq sample multiplexing strategy using lipid-tagged indices. MULTI-seq reagents can barcode any cell type from any species with an accessible plasma membrane. The method is compatible with enzymatic tissue dissociation, and also preserves viability and endogenous gene expression patterns. We leverage these features to multiplex the analysis of multiple solid tissues comprising human and mouse cells isolated from patient-derived xenograft mouse models. We also utilize MULTI-seq's modular design to perform a 96-plex perturbation experiment with human mammary epithelial cells. MULTI-seq also enables robust doublet identification, which improves data quality and increases scRNA-seq cell throughput by minimizing the negative effects of Poisson loading. We anticipate that the sample throughput and reagent savings enabled by MULTI-seq will expand the purview of scRNA-seq and democratize the application of these technologies within the scientific community.

Abstract Background Changes in microenvironment cell-cell interactions (CCI) during the progression from ductal carcinoma in situ (DCIS) to invasive ductal carcinoma (IDC) are poorly understood. Gene expression studies are confounded by cellular heterogeneity and few separate stromal and epithelial contributions, resulting in a lack of reliable prognostic biomarker to guide treatment decisions. Methods The gene expression of 293 microdissected regions from DCIS (92 epithelial, 31 stromal) and IDC (78 epithelial, 30 stromal) cases was aggregated from 6 datasets. Expression signatures of 6 cell lineages extracted from normal breast single-cell profiling were used to correct for differences in cell abundance. Subtype-specific functional differences between DCIS and IDC were measured for each region type using Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). DCIS-IDC stromal-epithelial interactions were compared using the expression product of 139 ligand-receptor (LR) pairs permuting the DCIS-IDC labels to assess significance. Results Variation in cell-lineage abundance separated epithelial regions into 4 clusters, including one enriched for DCIS (Myoepi-Enriched) and two for IDC (Infiltrated, Vascularized). GSEA on cell lineage normalized expression data identified subtype-independent changes in epithelial regions (induction of Extracellular Matrix maintenance genes, reduction of Tp53 signaling in IDC), as well as subtype-specific changes (proliferation in ER- and Her2-IDC, reduction in Nucleotide Excision Repair in ER+ IDC). In the stroma, Notch and Rho-GTPase signaling were induced in IDC irrespective of subtype. The stromal-epithelial interaction level of 6 and 4 LR pairs were significantly enriched in DCIS and IDC, respectively. Five of the 6 DCIS-enriched LR pairs involved ephrin interactions, with interaction level progressively decreasing from normal to DCIS to IDC. In contrast, 2 IDC-enriched LR pairs involved T-cell activity likely regulating Treg proliferation ( CD28-CD86 ) or T and NK cells stimulation ( CD226-PVR ). Notably, the bulk expression product of one identified LR pair ( EPHB4-EFNB1 ) was associated with poor survival in IDC (HR=1.47, p=0.04) suggesting that early remodeling of this stromal-epithelial interaction may have long-lasting impact on disease severity. Conclusions The observed changes in cell states and stromal-epithelial interactions, beyond those driven by difference in cell abundance, may lead to new biomarkers for prognosis and targets for secondary prevention.