ABSTRACT Rodent studies have demonstrated that synaptic dynamics from excitatory to inhibitory neuron types are often dependent on the target cell type. However, these target cell-specific properties have not been well investigated in human cortex, where there are major technical challenges in reliably identifying cell types. Here, we take advantage of newly developed methods for human neurosurgical tissue analysis with multiple patch-clamp recordings, post-hoc fluorescent in situ hybridization (FISH), and prospective GABAergic AAV-based labeling to investigate synaptic properties between pyramidal neurons and PVALB- vs. SST- positive interneurons. We find that there are robust molecular differences in synapse-associated genes between these neuron types, and that individual presynaptic pyramidal neurons evoke postsynaptic responses with heterogeneous synaptic dynamics in different postsynaptic cell types. Using molecular identification with FISH and classifiers based on transcriptomically identified PVALB neurons analyzed with Patch-seq methods, we find that PVALB neurons typically show depressing synaptic characteristics, whereas other interneuron types including SST-positive neurons show facilitating characteristics. Together, these data support the existence of target cell-specific synaptic properties in human cortex that are similar to rodent, thereby indicating evolutionary conservation of local circuit connectivity motifs from excitatory to inhibitory neurons and their synaptic dynamics.

Abstract Proper brain function requires the assembly and function of diverse populations of neurons and glia. Single cell gene expression studies have mostly focused on characterization of neuronal cell diversity; however, recent studies have revealed substantial diversity of glial cells, particularly astrocytes. To better understand glial cell types and their roles in neurobiology, we built a new suite of adeno-associated viral (AAV)-based genetic tools to enable genetic access to astrocytes and oligodendrocytes. These oligodendrocyte and astrocyte enhancer-AAVs are highly specific (usually > 95% cell type specificity) with variable expression levels, and our astrocyte enhancer-AAVs show multiple distinct expression patterns reflecting the spatial distribution of astrocyte cell types. To provide the best glial-specific functional tools, several enhancer-AAVs were: optimized for higher expression levels, shown to be functional and specific in rat and macaque, shown to maintain specific activity in epilepsy where traditional promoters changed activity, and used to drive functional transgenes in astrocytes including Cre recombinase and acetylcholine-responsive sensor iAChSnFR. The astrocyte-specific iAChSnFR revealed a clear reward-dependent acetylcholine response in astrocytes of the nucleus accumbens during reinforcement learning. Together, this collection of glial enhancer-AAVs will enable characterization of astrocyte and oligodendrocyte populations and their roles across species, disease states, and behavioral epochs.

During development, brain regions follow encoded growth trajectories. Compared to classical brain growth charts, high-definition growth charts could quantify regional volumetric growth and constituent cell types, improving our understanding of typical and pathological brain development. Here, we create high-resolution 3D atlases of the early postnatal mouse brain, using Allen CCFv3 anatomical labels, at postnatal days (P) 4, 6, 8, 10, 12, and 14, and determine the volumetric growth of different brain regions. We utilize 11 different cell type-specific transgenic animals to validate and refine anatomical labels. Moreover, we reveal region-specific density changes in γ-aminobutyric acid-producing (GABAergic), cortical layer-specific cell types, and microglia as key players in shaping early postnatal brain development. We find contrasting changes in GABAergic neuronal densities between cortical and striatal areas, stabilizing at P12. Moreover, somatostatin-expressing cortical interneurons undergo regionally distinct density reductions, while vasoactive intestinal peptide-expressing interneurons show no significant changes. Remarkably, microglia transition from high density in white matter tracks to gray matter at P10, and show selective density increases in sensory processing areas that correlate with the emergence of individual sensory modalities. Lastly, we create an open-access web-visualization (https://kimlab.io/brain-map/epDevAtlas) for cell-type growth charts and developmental atlases for all postnatal time points.

Abstract Identification of the structural connections between neurons is a prerequisite to understanding brain function. We developed a pipeline to systematically map brain-wide monosynaptic inputs to specific neuronal populations using Cre-driver mouse lines and the recombinant rabies tracing system. We first improved the rabies virus tracing strategy to accurately identify starter cells and to efficiently quantify presynaptic inputs. We then mapped brain-wide presynaptic inputs to different excitatory and inhibitory neuron subclasses in the primary visual cortex and seven higher visual areas. Our results reveal quantitative target-, layer- and cell-class-specific differences in the retrograde connectomes, despite similar global input patterns to different neuronal populations in the same anatomical area. The retrograde connectivity we define is consistent with the presence of the ventral and dorsal visual information processing streams and reveals further subnetworks within the dorsal stream. The hierarchical organization of the entire visual cortex can be derived from intracortical feedforward and feedback pathways mediated by upper- and lower-layer input neurons, respectively. This study expands our knowledge of the brain-wide inputs regulating visual areas and demonstrates that our improved rabies virus tracing strategy can be used to scale up the effort in dissecting connectivity of genetically defined cell populations in the whole mouse brain.

Mucus is a complex biological fluid that plays a variety of functional roles in many physiological systems. Intestinal mucus in particular serves as a physical barrier to pathogens, a medium for the diffusion of nutrients and metabolites, and an environmental home for colonizing microbes. Its rheological properties have therefore been the subject of many investigations, thus far limited, however, to in vitro studies due to the difficulty of measurement in the natural context of the gut. This limitation especially hinders our understanding of how the gut microbiota interact with the intestinal environment, since examination of this calls not only for in vivo measurement techniques, but for techniques that can be applied to model organisms in which the microbial state of the gut can be controlled. We address this challenge by developing a method that combines magnetic microrheology, light sheet fluorescence microscopy, and microgavage of particles, applying this to the larval zebrafish, a model vertebrate. We present measurements of the viscosity of mucus within the intestinal bulb of both germ-free (devoid of intestinal microbes) and conventionally reared larval zebrafish. At the length scale probed (≈ 10 μ m), we find that mucus behaves as a Newtonian fluid, with no discernable elastic component. Surprisingly, despite known differences in the the number of secretory cells in germ-free zebrafish and their conventional counterparts, the fluid viscosity for these two groups was very similar. Our measurements provide the first in vivo measurements of intestinal mucus rheology at micron length scales in living animals, quantifying of an important biomaterial environment and highlighting the utility of active magnetic microrheology for biophysical studies.

Expansion microscopy and light sheet imaging enable fine-scale resolution of intracellular features that comprise neural circuits. Most current techniques visualize sparsely distributed features across whole brains or densely distributed features within individual brain regions. Here, we visualize dense distributions of immunolabeled proteins across early visual cortical areas in adult macaque monkeys. This process may be combined with multiphoton or magnetic resonance imaging to produce multimodal atlases in large, gyrencephalic brains.

Light sheet fluorescence microscopy enables fast, minimally phototoxic, three-dimensional imaging of live specimens, but is currently limited by low throughput and tedious sample preparation. Here, we describe an automated high-throughput light sheet fluorescence microscope in which specimens are positioned by and imaged within a fluidic system integrated with the sheet excitation and detection optics. We demonstrate the ability of the instrument to rapidly examine live specimens with minimal manual intervention by imaging fluorescent neutrophils over a nearly 0.3 mm³ volume in dozens of larval zebrafish. In addition to revealing considerable inter-individual variability in neutrophil number, known previously from labor-intensive methods, three-dimensional imaging allows assessment of the correlation between the bulk measure of total cellular fluorescence and the spatially resolved measure of actual neutrophil number per animal. We suggest that our simple experimental design should considerably expand the scope and impact of light sheet imaging in the life sciences.

Abstract Fluorescence microscopy benefits from spatially and temporally homogeneous illumination with illumination area matched to the shape and size of the camera sensor. Fiber-coupled illumination schemes have the added benefit of straightforward and robust alignment and ease of installation compared to free-space coupled illumination. Commercial and open-source fiber-coupled, homogenized illumination schemes have recently become available to the public; however, there have been no published comparisons of speckle reduction schemes to date. We characterize three different multimode fibers in combination with two laser speckle reduction devices and compare spatial and temporal profiles to a commercial unit. This work yields a new design, the EvenField Illuminator, which is freely available along for researchers to integrate into their own imaging systems.

The mammalian cortex is comprised of cells with different morphological, physiological, and molecular properties that can be classified according to shared properties into cell types. Defining the contribution of each cell type to the computational and cognitive processes that are guided by the cortex is essential for understanding its function in health and disease. We use transcriptomic and epigenomic cortical cell type taxonomies from mice and humans to define marker genes and enhancers, and to build genetic tools for cortical cell types. Here, we present a large toolkit for selective targeting of cortical populations, including mouse transgenic lines and recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors containing genomic enhancers. We report evaluation of fifteen new transgenic driver lines and over 680 different enhancer AAVs covering all major subclasses of cortical cells, with many achieving a high degree of specificity, comparable with existing transgenic lines. We find that the transgenic lines based on marker genes can provide exceptional specificity and completeness of cell type labeling, but frequently require generation of a triple-transgenic cross for best usability/specificity. On the other hand, enhancer AAVs are easy to screen and use, and can be easily modified to express diverse cargo, such as recombinases. However, their use depends on many factors, such as viral titer and route of administration. The tools reported here as well as the scaled process of tool creation provide an unprecedented resource that should enable diverse experimental strategies towards understanding mammalian cortex and brain function.

Defining a complete set of cell types within the cortex requires reconciling disparate results achieved through diverging methodologies. To address this correspondence problem, multiple methodologies must be applied to the same cells across multiple single-cell experiments. Here we present a new approach applying spatial transcriptomics using multiplexed fluorescence in situ hybridization, (mFISH) to brain tissue previously interrogated through two photon optogenetic mapping of synaptic connectivity. This approach can resolve the anatomical, transcriptomic, connectomic, electrophysiological, and morphological characteristics of single cells within the mouse cortex.