Chromosomes are folded so that active and inactive chromatin domains are spatially segregated. Compartmentalization is thought to occur through polymer phase/microphase separation mediated by interactions between loci of similar type. The nature and dynamics of these interactions are not known. We developed liquid chromatin Hi-C to map the stability of associations between loci. Before fixation and Hi-C, chromosomes are fragmented removing the strong polymeric constraint to enable detection of intrinsic locus-locus interaction stabilities. Compartmentalization is stable when fragments are over 10-25 kb. Fragmenting chromatin into pieces smaller than 6 kb leads to gradual loss of genome organization. Dissolution kinetics of chromatin interactions vary for different chromatin domains. Lamin-associated domains are most stable, while interactions among speckle and polycomb-associated loci are more dynamic. Cohesin-mediated loops dissolve after fragmentation, possibly because cohesin rings slide off nearby DNA ends. Liquid chromatin Hi-C provides a genome-wide view of chromosome interaction dynamics.

The timing of DNA replication is largely regulated by the location and timing of replication origin firing. Therefore, much effort has been invested in identifying and analyzing human replication origins. However, the heterogeneous nature of eukaryotic replication kinetics and the low efficiency of individual origins in metazoans has made mapping the location and timing of replication initiation in human cells difficult. We have mapped early-firing origins in HeLa cells using Optical Replication Mapping, a high-throughput single-molecule approach based on Bionano Genomics genomic mapping technology. The single-molecule nature and 290-fold coverage of our dataset allowed us to identify origins that fire with as little as 1% efficiency. We find sites of human replication initiation in early S phase are not confined to well-defined efficient replication origins, but are instead distributed across broad initiation zones consisting of many inefficient origins. These early-firing initiation zones co-localize with initiation zones inferred from Okazaki-fragment-mapping analysis and are enriched in ORC1 binding sites. Although most early-firing origins fire in early-replication regions of the genome, a significant number fire in late-replicating regions, suggesting that the major difference between origins in early and late replicating regions is their probability of firing in early S-phase, as opposed to qualitative differences in their firing-time distributions. This observation is consistent with stochastic models of origin timing regulation, which explain the regulation of replication timing in yeast.

The dCasMINI protein is a hyper-compact, nuclease-inactivated CRISPR-Cas system engineered for transcriptional modulation and epigenetic editing [Xu et al., 2021]. The small size of dCasMini (529 amino acids), less than half the size of comparable Cas9 molecules, makes it ideal for AAV-based therapies which are frequently limited by AAVs small cargo capacity. Unlike Cas9 or Cas12a, there is no available computational tools for designing CasMINI guides. To facilitate and accelerate the development of dCasMINI-based applications, we synthesized knowledge regarding CasMINI guide design and built a website to assist researchers in designing optimal guides for dCasMINI-based experiments for transcriptional inhibition (CRISPRi) and activation (CRISPRa), which covers 99.7% of genes for CRISPRi and 99.9% of genes for CRISPRa. We experimentally characterized the importance of each nucleotide position on the guide RNA for determining its activity. Based on this information, , our tool offers more sensitively mapping off-targets and provides information about alignment mismatches in the spacer seed region, which we have experimentally determined to be critical for true binding events. The tool is freely available at casmini-tool.com.