A.Q. conceived of this project with M.G., led the development and optimization of the RD-SPRITE method, performed experiments, analyzed and interpreted data, generated figures, oversaw all aspects of the project, and wrote the paper.J.W.J. designed, performed, acquired, and analyzed all the RNA-FISH, DNA-FISH, IF, IF/RNA-FISH experiments and made all imaging figures; performed all LNA-related experiments and generated the figures and results; performed actinomycin D and Flavopiridol treatments and analysis; performed imaging of SHARP and Kcnq1ot1/Nap1l4 localization; contributed to the writing of the centromeric RNA hub section, model schematics/illustrations, and provided comments and edits on the entire manuscript.P.B. developed and optimized the RD-SPRITE protocol, performed SPRITE experiments, analyzed and interpreted data, contributed to data visualization, figure presentation, model schematics/illustrations, and wrote the paper.N.O.led the effort to analyze and interpret data, wrote software, created new methods for data analysis and visualization, performed analysis and visualization on the data and contributed major findings and results, created main and supplemental figures, and contributed to the initial draft of paper, model schematics/ illustrations, and reviewed and edited the manuscript.A.K.B. performed all Kcnq1ot1 biochemical and functional experiments, including CRISPRi knockdowns, TSA treatments, H3K27ac ChIP-seq and functional characterizations; worked with A.C. to develop and characterize the inducible Kcnq1ot1 cell line and to generate homozygous deletions of the SHARP Binding Site within Kcnq1ot1; worked with MRB to purify SHARP and map it to Kcnq1ot1.I.N.G. performed the data processing and analysis of the actinomycin D-treated SPRITE datasets; developed statistical methods for multiway RNA analyses, created new methods for data analysis and visualization; wrote scripts and constructed pipelines that enabled data curation; wrote and provided comments and edits for the manuscript, figures, supplemental tables, and methods.M.R.B. performed the actinomycin D RD-SPRITE and DNA-SPRITE experiments; performed analysis on the H3K27ac ChIP-seq; developed the engineered SHARP lines for CLAP and methods for purification of SHARP; worked with A.K.B. to perform SHARP purifications for Kcnq1ot1 binding; advised and helped to develop and optimize the RNA molecular biology of the RD-SPRITE method in this project.P.C. led the effort on the data processing and curation, writing scripts and constructing pipelines that enabled data interpretation of the RD-SPRITE dataset; was responsible for gene, repeat, and allele annotation as well as validation and producing several QC metrics; contributed to experimental optimization of the RNA-DNA SPRITE protocol.A.C. developed all engineered cell lines used in this study, including the doxycycline inducible Xist cell lines, Kcnq1ot1 lines, SHARP binding site deletions, and dCas9 cell lines.Y.M. performed all live-cell 3D-SIM imaging and analysis of FL-SHARP and ΔRRM-SHARP localization.J.T. helped develop and maintain engineered cell lines used in this study; aided in the preparation of samples used in this study.K.P. provided guidance and support on imaging, analysis, ideas, and discussions on the paper.M.G. conceived of this project with S.A.Q. and oversaw all experiments and analysis; performed computational analysis and generated scripts for analyzing the RD-SPRITE data; and wrote the paper.

ABSTRACT In eukaryotes, the nucleus is organized into a three dimensional structure consisting of both local interactions such as those between enhancers and promoters, and long-range higher-order structures such as nuclear bodies. This organization is central to many aspects of nuclear function, including DNA replication, transcription, and cell cycle progression. Nuclear structure intrinsically occurs within single cells; however, measuring such a broad spectrum of 3D DNA interactions on a genome-wide scale and at the single cell level has been a great challenge. To address this, we developed single-cell split-pool recognition of interactions by tag extension (scSPRITE), a new method that enables measurements of genome-wide maps of 3D DNA structure in thousands of individual nuclei. scSPRITE maximizes the number of DNA contacts detected per cell enabling high-resolution genome structure maps within each cells and is easy-to-use and cost-effective. scSPRITE accurately detects chromosome territories, active and inactive compartments, topologically associating domains (TADs), and higher-order structures within single cells. In addition, scSPRITE measures cell-to-cell heterogeneity in genome structure at different levels of resolution and shows that TADs are dynamic units of genome organization that can vary between different cells within a population. scSPRITE will improve our understanding of nuclear architecture and its relationship to nuclear function within an individual nucleus from complex cell types and tissues containing a diverse population of cells.

Although thousands of lncRNAs are encoded in mammalian genomes, their mechanisms of action are largely uncharacterized because they are often expressed at significantly lower levels than their proposed targets. One such lncRNA is Xist, which mediates chromosome-wide gene silencing on one of the two X chromosomes to achieve gene expression balance between males and females. How a limited number of Xist molecules can mediate robust silencing of a significantly larger number of target genes (∼1 Xist RNA: 10 gene targets) while maintaining specificity to genes on the X within each cell is unknown. Here, we show that Xist drives non-stoichiometric recruitment of the essential silencing protein SHARP (also called Spen) to amplify its abundance across the inactive X, including at regions not directly occupied by Xist. This amplification is achieved through concentration-dependent homotypic assemblies of SHARP on the X and is required for chromosome-wide silencing. We find that expressing Xist at higher levels leads to increased localization at autosomal regions, demonstrating that low levels of Xist are critical for ensuring its specificity to the X chromosome. We show that Xist (through SHARP) acts to suppress production of its own RNA which may act to constrain overall RNA levels and restrict its ability to spread beyond the X. Together, our results demonstrate a spatial amplification mechanism that allows Xist to achieve two essential but countervailing regulatory objectives: chromosome-wide gene silencing and specificity to the X. Our results suggest that this spatial amplification mechanism may be a more general mechanism by which other low abundance lncRNAs can balance specificity to, and robust control of, their regulatory targets.

SUMMARY The nucleus is a highly organized arrangement of RNA, DNA, and protein molecules that are compartmentalized within three-dimensional (3D) structures involved in shared functional and regulatory processes. Although RNA has long been proposed to play a global role in organizing nuclear structure, exploring the role of RNA in shaping nuclear structure has remained a challenge because no existing methods can simultaneously measure RNA-RNA, RNA-DNA, and DNA-DNA contacts within 3D structures. To address this, we developed RNA & DNA SPRITE (RD-SPRITE) to comprehensively map the location of all RNAs relative to DNA and other RNAs. Using this approach, we identify many RNAs that are localized near their transcriptional loci (RNA-DNA) together with other diffusible ncRNAs (RNA-RNA) within higher-order DNA structures (DNA-DNA). These RNA-chromatin compartments span three major classes of nuclear functions: RNA processing (including ribosome biogenesis, mRNA splicing, snRNA biogenesis, and histone mRNA processing), heterochromatin assembly, and gene regulation. More generally, we identify hundreds of ncRNAs that form stable nuclear compartments in spatial proximity to their transcriptional loci. We find that dozens of nuclear compartments require RNA to guide protein regulators into these 3D structures, and focusing on several ncRNAs, we show that these ncRNAs specifically regulate heterochromatin assembly and the expression of genes contained within these compartments. Together, our results demonstrate a unique mechanism by which RNA acts to shape nuclear structure by forming high concentration territories immediately upon transcription, binding to diffusible regulators, and guiding them into spatial compartments to regulate a wide range of essential nuclear functions.

Abstract Accurate repair of DNA damage is critical for maintenance of genomic integrity and cellular survival. Because damage occurs non-uniformly across the genome, single-cell resolution is required for proper interrogation, but sensitive detection has remained challenging. Here, we present genome-wide binding profiles of DNA double-strand break repair proteins in single cells, allowing for the study of heterogeneity in genomic damage locations and associated repair features. By unbiasedly detecting repair-enriched segments, we find that repair proteins often occupy entire topologically associating domains and mimic variability in chromatin loop anchoring. Genomic loci that form damage-specific 3D contacts show multi-way repair coordination in individual cells that becomes stronger according to the number of interaction partners. These findings advance our understanding of genome stability in the context of nuclear organization.