In order to survey a universe of major histocompatibility complex (MHC)-presented peptide antigens whose numbers greatly exceed the diversity of the T cell repertoire, T cell receptors (TCRs) are thought to be cross-reactive. However, the nature and extent of TCR cross-reactivity has not been conclusively measured experimentally. We developed a system to identify MHC-presented peptide ligands by combining TCR selection of highly diverse yeast-displayed peptide-MHC libraries with deep sequencing. Although we identified hundreds of peptides reactive with each of five different mouse and human TCRs, the selected peptides possessed TCR recognition motifs that bore a close resemblance to their known antigens. This structural conservation of the TCR interaction surface allowed us to exploit deep-sequencing information to computationally identify activating microbial and self-ligands for human autoimmune TCRs. The mechanistic basis of TCR cross-reactivity described here enables effective surveillance of diverse self and foreign antigens without necessitating degenerate recognition of nonhomologous peptides.

Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2), which causes COVID-19, utilizes angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) for entry into target cells. ACE2 has been proposed as an interferon-stimulated gene (ISG). Thus, interferon-induced variability in ACE2 expression levels could be important for susceptibility to COVID-19 or its outcomes. Here, we report the discovery of a novel, primate-specific isoform of ACE2, which we designate as deltaACE2 (dACE2). We demonstrate that dACE2, but not ACE2, is an ISG. In vitro, dACE2, which lacks 356 N-terminal amino acids, was non-functional in binding the SARS-CoV-2 spike protein and as a carboxypeptidase. Our results reconcile current knowledge on ACE2 expression and suggest that the ISG-type induction of dACE2 in IFN-high conditions created by treatments, inflammatory tumor microenvironment, or viral co-infections is unlikely to affect the cellular entry of SARS-CoV-2 and promote infection.

Abstract Type I and III Interferons (IFN) constitute the host system’s first line of defense against viral infections. Although the two families use distinct extracellular receptor complexes, an identical pair of Janus kinases (JAK) activates a similar set of signal transducer and activator of transcription (STATs) through a conserved pathway. Consequently, type I and III IFNs are presumed to activate a largely overlapping set of IFN-stimulated genes (ISGs) and elicit similar biological responses. Therapeutically, type III IFNs are attractive alternatives to type I IFNs due to their innate tissue specificity and lower systemic toxicity. However, a major limitation of type III IFNs is the significantly lower potency of their physiological activities compared to type I IFNs. To evaluate the role of receptor geometry in IFN signaling, we engineered cell lines that express wild-type and mutant IFNλ receptors (IFNλR1) with rotated intracellular registers with respect to the associated JAK1. Evaluation of downstream signaling and biological activity of type III IFNs in cells with varied JAK-JAK geometries uncovered variant receptors that result in potentiation of type III IFN signaling and all downstream activities. With the combined use of a high-affinity ligand to stabilize the extracellular receptor complex, we found that the optimization of the intracellular JAK-JAK geometry enhances the type III IFN antiviral and anti-proliferative activities by 2- and 3-logs, respectively. In addition to providing a molecular basis for the observed differences in potency between type I and III IFNs, this work provides deeper insights into broader cytokine signaling mechanisms and novel blueprints for modulating cytokine functions to develop next generation antiviral and anticancer therapeutics.

As antimicrobial signalling molecules, type III or lambda interferons (IFNλs) are critical for defence against infection by diverse pathogens. Counter-intuitively, expression of one member of the family, IFNλ4, is associated with decreased clearance of hepatitis C virus (HCV) in the human population; by contrast, a natural in-frame nucleotide insertion that abrogates IFNλ4 production improves viral clearance. To further understand how genetic variation between and within species affects IFNλ4 function, we screened a panel of extant coding variants of human IFNλ4 and identified three variants that substantially affect antiviral activity (P70S, L79F and K154E). The most notable variant was K154E, which enhanced in vitro activity in a range of antiviral and interferon stimulated gene (ISG) assays. This more active E154 variant of IFNλ4 was found only in African Congo rainforest Pygmy hunter-gatherers. Remarkably, E154 was highly conserved as the ancestral residue in mammalian IFNλ4s yet K154 is the dominant variant throughout evolution of the hominid genus Homo. Compared to chimpanzee IFNλ4, the human orthologue had reduced activity due to amino acid substitution of glutamic acid with lysine at position 154. Meta-analysis of published gene expression data from humans and chimpanzees showed that this difference in activity between K154 and E154 in IFNλ4 is consistent with differences in antiviral gene expression in vivo during HCV infection. Mechanistically, our data suggest that human-specific K154 likely affects IFNλ4 activity by reducing secretion and potency. We postulate that evolution of an IFNλ4 with attenuated activity in humans (K154) likely contributes to distinct host-specific responses to and outcomes of infection, such as HCV.

It is currently believed that type I and III interferons (IFNs) have redundant functions. However, the preferential distribution of type III IFN receptor on epithelial cells suggests functional differences at epithelial surfaces. Here, using human intestinal epithelial cells we could show that although both type I and type III IFNs confer an antiviral state to the cells, they do so with distinct kinetics. Type I IFN signaling is characterized by an acute strong induction of interferon stimulated genes (ISGs) and confers fast antiviral protection. On the contrary, the slow acting type III IFN mediated antiviral protection is characterized by a weaker induction of ISGs in a delayed manner compared to type I IFN. Moreover, while transcript profiling revealed that both IFNs induced a similar set of ISGs, their temporal expression strictly depended on the IFNs, thereby leading to unique antiviral environments. Using a combination of data-driven mathematical modeling and experimental validation, we addressed the molecular reason for this differential kinetic of ISG expression. We could demonstrate that these kinetic differences are intrinsic to each signaling pathway and not due to different expression levels of the corresponding IFN receptors. We report that type III IFN is specifically tailored to act in specific cell types not only due to the restriction of its receptor but also by providing target cells with a distinct antiviral environment compared to type I IFN. We propose that this specific environment is key at surfaces that are often challenged with the extracellular environment.

ABSTRACT Netrins can dictate attractive and repulsive responses during axon growth and cell migration, where presence of the receptor UNC-5 on target cells results in Netrin-mediated repulsion. Molecular details of Netrin–UNC-5 interactions and how they signal remain elusive. Here, we show that nematode UNC-5 is a heparin-binding protein, and the UNC-5–heparin affinity can be modulated using directed evolution or via rational design using our novel structure of UNC-5 with a heparin fragment. Furthermore, UNC-5 and nematode UNC-6/Netrin form a large, stable and rigid oligomeric complex in the presence of heparin, which can incorporate the attractive UNC-40/DCC receptor, demonstrating binary and ternary ectodomain complexes at preparative scale. C. elegans with a heparin-binding deficient UNC-5 fail to establish proper gonad morphology due to abrogated distal tip cell migration, which relies on repulsive UNC-5 signaling in response to UNC-6. Our findings establish Netrin responses to be mediated through glycosaminoglycan-regulated large macromolecular complexes.