A key aspect of nearly all single-cell sequencing experiments is dissociation of intact tissues into single-cell suspensions. While many protocols have been optimized for optimal cell yield, they have often overlooked the effects that dissociation can have on ex vivo gene expression. Here, we demonstrate that use of enzymatic dissociation on brain tissue induces an aberrant ex vivo gene expression signature, most prominently in microglia, which is prevalent in published literature and can substantially confound downstream analyses. To address this issue, we present a rigorously validated protocol that preserves both in vivo transcriptional profiles and cell-type diversity and yield across tissue types and species. We also identify a similar signature in postmortem human brain single-nucleus RNA-sequencing datasets, and show that this signature is induced in freshly isolated human tissue by exposure to elevated temperatures ex vivo. Together, our results provide a methodological solution for preventing artifactual gene expression changes during fresh tissue digestion and a reference for future deeper analysis of the potential confounding states present in postmortem human samples.

Abstract Microglia have emerged as key players in the pathogenesis of neurodegenerative conditions such as Alzheimer’s disease (AD). In response to CNS stimuli, these cells adopt distinct transcriptional and functional subtypes known as states. However, an understanding of the function of these states has been elusive, especially in human microglia, due to lack of tools to model and manipulate this cell-type. Here, we provide a platform for modeling human microglia transcriptional states in vitro . Using single-cell RNA sequencing, we found that exposure of human stem-cell differentiated microglia (iMGLs) to brain-related challenges generated extensive transcriptional diversity which mapped to gene signatures identified in human brain microglia. We identified two in vitro transcriptional clusters that were analogous to human and mouse disease-associated microglia (DAMs), a state enriched in neurodegenerative disease contexts. To facilitate scalable functional analyses, we established a lentiviral approach enabling broad and highly efficient genetic transduction of microglia in vitro . Using this new technology, we demonstrated that MITF (Melanocyte Inducing Transcription Factor), an AD-enriched transcription factor in microglia, drives both a disease-associated transcriptional signature and a highly phagocytic state. Finally, we confirmed these results across iMGLs differentiated from multiple iPSC lines demonstrating the broad utility of this platform. Together, these tools provide a comprehensive resource that enables the manipulation and functional interrogation of human microglial states in both homeostatic and disease-relevant contexts.

Abstract A key aspect of nearly all single cell experiments is the necessity to dissociate intact tissues into single cell suspensions for processing. While many protocols have been optimized for optimal cell yield, they have often overlooked the effects that dissociation can have on ex vivo gene expression changes during this process. Microglia, the brain’s resident macrophages, are a highly dynamic population that are extremely sensitive to their microenvironment and have been shown to dramatically alter their transcriptome upon stimulation. We demonstrate that use of enzymatic dissociation methods on mouse central nervous system (CNS) tissue induces an aberrant gene expression signature in microglia that can significantly confound downstream analysis. To minimize this issue, we developed a flexible protocol, that can be used with existing enzymatic protocols for fresh tissue, to eliminate artifactual gene expression while allowing for increased cell type diversity and yield. We demonstrate efficacy of this protocol in analysis of diverse CNS cell types and sorted myeloid populations while using enzymatic dissociation. Generation of new and reanalysis of previously published human brain single nucleus RNAseq (snRNA-seq) datasets reveal that a similar signature is also present in post-mortem tissue. Through novel snRNA-seq analysis of acutely-resected neurosurgical tissue we demonstrate that this signature can be induced in human tissue due to technical differences in sample processing. These results provide key insight into the potential confounds of enzymatic digestion and provide a solution to allow for enzymatic digestion for scRNA-seq while avoiding ex vivo transcriptional artifacts. Analysis of human tissue reveals potential for artifacts in current and future snRNA-seq datasets that will require deeper analysis and careful consideration to separate true biology from artifacts related to post-mortem processes.