Summary

 Acquisition of the intestinal microbiota begins at birth, and a stable microbial community develops from a succession of key organisms. Disruption of the microbiota during maturation by low-dose antibiotic exposure can alter host metabolism and adiposity. We now show that low-dose penicillin (LDP), delivered from birth, induces metabolic alterations and affects ileal expression of genes involved in immunity. LDP that is limited to early life transiently perturbs the microbiota, which is sufficient to induce sustained effects on body composition, indicating that microbiota interactions in infancy may be critical determinants of long-term host metabolic effects. In addition, LDP enhances the effect of high-fat diet induced obesity. The growth promotion phenotype is transferrable to germ-free hosts by LDP-selected microbiota, showing that the altered microbiota, not antibiotics per se, play a causal role. These studies characterize important variables in early-life microbe-host metabolic interaction and identify several taxa consistently linked with metabolic alterations. 

PaperClip

From Genome to Regulatory Networks For biologists, having a genome in hand is only the beginning—much more investigation is still needed to characterize how the genome is used to help to produce a functional organism (see the Perspective by Blaxter ). In this vein, Gerstein et al. (p. 1775 ) summarize for the Caenorhabditis elegans genome, and The modENCODE Consortium (p. 1787 ) summarize for the Drosophila melanogaster genome, full transcriptome analyses over developmental stages, genome-wide identification of transcription factor binding sites, and high-resolution maps of chromatin organization. Both studies identified regions of the nematode and fly genomes that show highly occupied targets (or HOT) regions where DNA was bound by more than 15 of the transcription factors analyzed and the expression of related genes were characterized. Overall, the studies provide insights into the organization, structure, and function of the two genomes and provide basic information needed to guide and correlate both focused and genome-wide studies.

Abstract Pancreatic cancer is the most lethal common solid malignancy. Systemic therapies are often ineffective, and predictive biomarkers to guide treatment are urgently needed. We generated a pancreatic cancer patient–derived organoid (PDO) library that recapitulates the mutational spectrum and transcriptional subtypes of primary pancreatic cancer. New driver oncogenes were nominated and transcriptomic analyses revealed unique clusters. PDOs exhibited heterogeneous responses to standard-of-care chemotherapeutics and investigational agents. In a case study manner, we found that PDO therapeutic profiles paralleled patient outcomes and that PDOs enabled longitudinal assessment of chemosensitivity and evaluation of synchronous metastases. We derived organoid-based gene expression signatures of chemosensitivity that predicted improved responses for many patients to chemotherapy in both the adjuvant and advanced disease settings. Finally, we nominated alternative treatment strategies for chemorefractory PDOs using targeted agent therapeutic profiling. We propose that combined molecular and therapeutic profiling of PDOs may predict clinical response and enable prospective therapeutic selection. Significance: New approaches to prioritize treatment strategies are urgently needed to improve survival and quality of life for patients with pancreatic cancer. Combined genomic, transcriptomic, and therapeutic profiling of PDOs can identify molecular and functional subtypes of pancreatic cancer, predict therapeutic responses, and facilitate precision medicine for patients with pancreatic cancer. Cancer Discov; 8(9); 1112–29. ©2018 AACR. See related commentary by Collisson, p. 1062. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 1047

Canonical animal microRNAs (miRNAs) are generated by sequential cleavage of precursor substrates by the Drosha and Dicer RNase III enzymes. Several variant pathways exploit other RNA metabolic activities to generate functional miRNAs. However, all of these pathways culminate in Dicer cleavage, suggesting that this is a unifying feature of miRNA biogenesis. Here, we show that maturation of miR-451, a functional miRNA that is perfectly conserved among vertebrates, is independent of Dicer. Instead, structure-function and knockdown studies indicate that Drosha generates a short pre-mir-451 hairpin that is directly cleaved by Ago2 and followed by resection of its 3' terminus. We provide stringent evidence for this model by showing that Dicer knockout cells can generate mature miR-451 but not other miRNAs, whereas Ago2 knockout cells reconstituted with wild-type Ago2, but not Slicer-deficient Ago2, can process miR-451. Finally, we show that the mir-451 backbone is amenable to reprogramming, permitting vector-driven expression of diverse functional miRNAs in the absence of Dicer. Beyond the demonstration of an alternative strategy to direct gene silencing, these observations open the way for transgenic rescue of Dicer conditional knockouts.

Small RNAs of the piRNA (Piwi-associated RNA) class have various functions in the germline — repressing transposable elements, maintaining germline stem cells and promoting genome stability. Rouget et al. have now uncovered a function for piRNAs outside the germline, in the fruit fly embryo. Specifically, piRNAs that are complementary to a sequence in the 3′-untranslated region of an mRNA for the embryonic posterior morphogen Nanos facilitate adenylation of the mRNA and its subsequent decay. Without piRNAs, Nanos accumulates and developmental defects result. Piwi-associated RNAs (piRNAs) are small RNAs with several functions in the germline, such as repressing transposable elements and helping to maintain germline stem cells. Now, a function for piRNAs has been discovered outside the germline, in the fruitfly embryo. Specifically, piRNAs are required for the decay of the messenger RNA encoding the posterior morphogen Nanos. When piRNA-induced regulation is impaired, this mRNA is stabilized and developmental defects ensue. Piwi-associated RNAs (piRNAs), a specific class of 24- to 30-nucleotide-long RNAs produced by the Piwi-type of Argonaute proteins, have a specific germline function in repressing transposable elements. This repression is thought to involve heterochromatin formation and transcriptional and post-transcriptional silencing1,2,3,4,5,6. The piRNA pathway has other essential functions in germline stem cell maintenance7 and in maintaining germline DNA integrity8,9,10. Here we uncover an unexpected function of the piRNA pathway in the decay of maternal messenger RNAs and in translational repression in the early embryo. A subset of maternal mRNAs is degraded in the embryo at the maternal-to-zygotic transition. In Drosophila, maternal mRNA degradation depends on the RNA-binding protein Smaug and the deadenylase CCR411,12,13, as well as the zygotic expression of a microRNA cluster14. Using mRNA encoding the embryonic posterior morphogen Nanos (Nos) as a paradigm to study maternal mRNA decay, we found that CCR4-mediated deadenylation of nos depends on components of the piRNA pathway including piRNAs complementary to a specific region in the nos 3′ untranslated region. Reduced deadenylation when piRNA-induced regulation is impaired correlates with nos mRNA stabilization and translational derepression in the embryo, resulting in head development defects. Aubergine, one of the Argonaute proteins in the piRNA pathway, is present in a complex with Smaug, CCR4, nos mRNA and piRNAs that target the nos 3′ untranslated region, in the bulk of the embryo. We propose that piRNAs and their associated proteins act together with Smaug to recruit the CCR4 deadenylation complex to specific mRNAs, thus promoting their decay. Because the piRNAs involved in this regulation are produced from transposable elements, this identifies a direct developmental function for transposable elements in the regulation of gene expression.

Oncogenic Suspect Exposed It can be difficult logistically to study the genomics of rare variants of common cancers. Nevertheless, Honeyman et al. (p. 1010 ) studied fibrolamellar hepatocellular carcinoma (FL-HCC), a rare and poorly understood liver tumor that affects adolescents and young adults and for which there is no effective treatment. FL-HCCs from 15 patients all expressed a chimeric RNA transcript and protein containing sequences from a molecular chaperone fused in frame with sequences from the catalytic domain of protein kinase A. The chimeric protein retained kinase activity in vitro. Such recurrent gene fusions in cancer may signal a role in pathogenesis and provide an opportunity for therapeutic intervention.

Article11 December 2008free access Histone H3 lysine 4 trimethylation marks meiotic recombination initiation sites Valérie Borde Valérie Borde Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France Search for more papers by this author Nicolas Robine Nicolas Robine Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France Institut Curie Centre de Recherche, INSERM U900, Mines ParisTech, France Search for more papers by this author Waka Lin Waka Lin Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France Search for more papers by this author Sandrine Bonfils Sandrine Bonfils CNRS, UPR3081, Laboratoire d'Instabilité Génétique et Cancérogenèse, Marseille, France Search for more papers by this author Vincent Géli Corresponding Author Vincent Géli CNRS, UPR3081, Laboratoire d'Instabilité Génétique et Cancérogenèse, Marseille, France Search for more papers by this author Alain Nicolas Corresponding Author Alain Nicolas Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France Search for more papers by this author Valérie Borde Valérie Borde Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France Search for more papers by this author Nicolas Robine Nicolas Robine Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France Institut Curie Centre de Recherche, INSERM U900, Mines ParisTech, France Search for more papers by this author Waka Lin Waka Lin Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France Search for more papers by this author Sandrine Bonfils Sandrine Bonfils CNRS, UPR3081, Laboratoire d'Instabilité Génétique et Cancérogenèse, Marseille, France Search for more papers by this author Vincent Géli Corresponding Author Vincent Géli CNRS, UPR3081, Laboratoire d'Instabilité Génétique et Cancérogenèse, Marseille, France Search for more papers by this author Alain Nicolas Corresponding Author Alain Nicolas Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France Search for more papers by this author Author Information Valérie Borde1,‡, Nicolas Robine1,2,‡, Waka Lin1,‡, Sandrine Bonfils3, Vincent Géli 3 and Alain Nicolas 1 1Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France 2Institut Curie Centre de Recherche, INSERM U900, Mines ParisTech, France 3CNRS, UPR3081, Laboratoire d'Instabilité Génétique et Cancérogenèse, Marseille, France ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding authors. CNRS UPR3081, Marseille, F-13000, France and Institut Curie Centre de Recherche, UMR7147 CNRS, 26, rue d, Ulm, Paris, F-75248, France. Tel.: +33 1 56246520; Fax: +33 1 56246644; E-mail: [email protected] or E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2009)28:99-111https://doi.org/10.1038/emboj.2008.257 There is a Have you seen ...? (January 2009) associated with this Article. PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The function of histone modifications in initiating and regulating the chromosomal events of the meiotic prophase remains poorly understood. In Saccharomyces cerevisiae, we examined the genome-wide localization of histone H3 lysine 4 trimethylation (H3K4me3) along meiosis and its relationship to gene expression and position of the programmed double-strand breaks (DSBs) that initiate interhomologue recombination, essential to yield viable haploid gametes. We find that the level of H3K4me3 is constitutively higher close to DSB sites, independently of local gene expression levels. Without Set1, the H3K4 methylase, 84% of the DSB sites exhibit a severely reduced DSB frequency, the reduction being quantitatively correlated with the local level of H3K4me3 in wild-type cells. Further, we show that this differential histone mark is already established in vegetative cells, being higher in DSB-prone regions than in regions with no or little DSB. Taken together, our results demonstrate that H3K4me3 is a prominent and preexisting mark of active meiotic recombination initiation sites. Novel perspectives to dissect the various layers of the controls of meiotic DSB formation are discussed. Introduction The genomes of eukaryotes are packaged into chromatin, the fundamental unit of which is the nucleosome, composed of a histone octamer. The position of the nucleosomes and the chemical modifications of histones are critical to a large number of cellular functions, including changes in gene expression during cell differentiation. Features of chromatin structure and histone modifications are also involved in the control of genome stability, both to faithfully perpetuate chromosomal organization and to dynamically regulate chromatin structure to allow DNA repair. One of the most studied histone modifications is histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation (Dehe and Geli, 2006; Ruthenburg et al, 2007). In vertebrates, H3K4 di- and trimethylation (H3K4me2 and H3K4me3) occur in discrete zones in the proximity of transcriptionally active gene promoters (Schneider et al, 2004; Bernstein et al, 2005; Barski et al, 2007; Heintzman et al, 2007). Genome-wide studies in exponentially growing Saccharomyces cerevisiae cells show that H3K4me3 peaks at the start of transcribed portions of genes (Pokholok et al, 2005). H3K4me3 is thought to facilitate transcription through the recruitment of nucleosome remodelling complexes and histone-modifying enzymes, and by preventing repressors from binding to chromatin (Berger, 2007; Venkatasubrahmanyam et al, 2007). However, the function of H3K4me3 in gene activation is not clear, as the expression of most genes was found to be unchanged in the absence of H3K4 methylation (Bernstein et al, 2002). Besides transcription, the H3K4me3 mark is associated with other biological functions. H3K4me3 has an important function in mammalian V(D)J recombination by recruiting the RAG2 protein through recognition of its PHD domain (Liu et al, 2007; Matthews et al, 2007). In this study, we have uncovered the essential function of H3K4me3 in the initiation of meiotic recombination, distinct from its tight association with meiotic gene expression. During meiosis, a diploid cell produces haploid gametes (spores in yeast) for sexual reproduction, with two consecutive rounds of chromosomes segregation. Unique chromosomal events occur during MI prophase (Zickler and Kleckner, 1999), including genome-wide homologous recombination, initiated by programmed formation of double-strand breaks (DSBs) and essential for proper chromosome segregation and fertility (Hassold et al, 2007). Meiosis also involves substantial transcriptional reprogramming (Chu et al, 1998; Primig et al, 2000). Both massive changes of expression and induction of recombination are expected to involve chromatin structure modifications. A first hint for a function of chromatin structure in DSB formation was the finding that the recombination hot spots are located in chromatin that is constitutively open before entry into meiosis (Ohta et al, 1994; Wu and Lichten, 1994) and exhibit a specific increase of sensitivity to MNase, shortly before DSB formation (Ohta et al, 1994; Murakami et al, 2003). In addition, DSB formation at well-characterized hot spots is strongly reduced in the absence of Set1, the only H3K4 methyltransferase in S. cerevisiae (Sollier et al, 2004). Finally, Rad6, which mediates methylation of H3K4 through ubiquitylation of the H2B lysine 123, is also required for full levels of meiotic DSBs (Yamashita et al, 2004). These and other studies on S. cerevisiae (Mieczkowski et al, 2007), S. pombe (Yamada et al, 2004) and Caenorhabditis elegans (Reddy and Villeneuve, 2004) suggest that post-translational histone modifications regulate DSB formation, but histone states at or near the DSB sites remain to be examined and the local versus general features of the DSB regions remain to be distinguished. Here, we have studied in S. cerevisiae the relations between H3K4me3 levels and both meiotic mRNA levels and DSB formation. We show that the level of H3K4me3 is constitutively high in DSB-prone regions, independently of local gene transcript level, and that without Set1, DSB formation is severely reduced at 84% of the wild-type DSB sites, the reduction being quantitatively correlated with the level of H3K4me3 in wild-type cells. We conclude that H3K4me3 is a prominent mark of active meiotic recombination initiation sites. Our data also provide new insights to explain the heterogeneous distribution of recombination initiation events along the chromosomes as well as the evolution of recombination initiation sites without major DNA sequence modification. Results Meiotic DSBs are strongly reduced in the absence of H3K4 methylation As DSB frequencies are reduced about five-fold at the YCR047C and CYS3 loci in set1Δ cells (Sollier et al, 2004) (Figure 1A), we asked to which extent Set1 controls DSB formation in the entire genome. To determine the distribution of DSB frequencies in SET1 and set1Δ cells, we used cells mutated for DMC1, which encodes the meiosis-specific Rad51 homologue. In such cells, all meiotic DSBs are formed, but accumulate with 3′ ended single strand tails, covered with replication protein A (RPA). At the time when DSBs accumulate (5 h in the SET1 and 7 h in the set1Δ cells), we performed chromatin immunoprecipitation of Rfa1, an RPA component (Johnson et al, 2007) (Figure 1B). Quantitative PCR analysis of immunoprecipitated DNA confirmed the enrichment at the DSB hot spot (YCR047C) fragment relative to ribosomal RNA genes, where meiotic DSBs are absent (Figure 1C). The enrichment was significant in both strains, but five times lower in the set1Δ strain. This is identical to the reduction of DSB frequency observed by Southern blot at this locus (Sollier et al, 2004 and Figure 1A). It has been shown recently that meiotic DSBs occur at many places in the genome, but with varying frequencies (Buhler et al, 2007). The genome-wide mapping of the DSB sites detected as RPA-enriched sites by ChIP-chip (Supplementary Figure S1 and Table S1) allowed us to define the ‘hottest’ DSB sites in the genome, for both WT and set1Δ strains, as having a five-fold enrichment over experimental background. In the SET1 strain, there were 1013 such hot spots, but only 317 in the set1Δ strain (Figure 1D and Supplementary Tables S2 and S3). Out of the 1013 hottest DSBs, 742 (73%) are located at less than 1 kb from one of the hottest dmc1Δ DSBs mapped by a different approach but defined with similar criteria (Buhler et al, 2007), and out of the 100 strongest DSBs, 95 DSB sites are found also in Buhler's study, showing that the results from the two studies are very similar (see Supplementary Figure S2 for comparison of our set of DSBs with that of Buhler et al. and of Blitzblau et al, 2007). A total of 84% of the DSB hot spots of the wild-type strain show a greater than 1.5-fold reduction in the absence of Set1 (70 % exhibit a more than two-fold reduction) and the majority (77%) of the DSB hot spot peaks in set1Δ coincides with the DSB hot spot peaks observed in wild type (Figure 1D). However, even if globally the DSB profiles are flatter in the absence of Set1, locus-specific differences exist, such as that on chromosomes VI and X near the PES4 and SET4 loci, respectively, which show stronger DSB in set1Δ (Figure 1E). Further analyses of DSB formation in the absence of Set1 are presented later. In summary, our results show that with few exceptions, the inactivation of Set1 severely reduces DSB frequencies. These results led us to examine the genome-wide distribution of H3K4 trimethylation mark during meiosis. Figure 1.Meiotic DSB formation is globally reduced in the absence of histone H3K4 methylation. (A) Southern blot analysis of DSB formation in the promoter of YCR047C (arrow). The blot contains AseI-digested DNA from meiotic samples of SET1 dmc1Δ (ORD7354) and set1Δ dmc1Δ (ORD9624) cells. Maximal DSB frequencies (% total lane signal) observed during each time course are indicated to the right of the blot. (B) Schematic representation of the procedure using ChIP of RPA to enrich for meiotic DSBs accumulating in dmc1Δ cells. (C) Quantitative PCR measurement of RPA enrichment for sequences close to the YCR047C DSB hot spot relative to ribosomal DNA (rDNA). Data are from two independent samples for each strain taken at 5 h (SET1 dmc1Δ) or 7 h (set1Δ dmc1Δ) in meiosis. Error bars represent standard deviations. (D) The number of DSB sites is strongly reduced in the absence of SET1. The Venn diagram shows the overlap between the DSBs sites occurring in dmc1Δ and in set1Δ dmc1Δ. The DSB peaks were identified from the RPA chip-chip data after smoothing (Supplementary data). (E) Examples of DSBs signals in set1Δ. Three chromosomes are represented. For each one, unsmoothed array signals of RPA enrichment over background are displayed according to their chromosomal coordinates. Below the graphs, blue and red circles indicate positions of the DSB peaks determined in SET1 dmc1Δ and set1Δ dmc1Δ, respectively. Green dots indicate sites stronger in set1Δ. CYS3 is an example of a DSB site no longer cut in set1Δ, whereas PES4 and SET4 sites are stronger in the absence of SET1. Download figure Download PowerPoint Dynamics of H3K4 trimethylation during meiosis We characterized the levels of H3K4me3 residue as well as total histone H3 associated with chromatin in a S. cerevisiae wild-type diploid strain by ChIP-chip. The synchronous progression in meiosis was verified by fluorescence microscopy of DAPI-stained nuclei (Figure 2A). Western blot analysis showed that amounts of H3K4me3 relative to total histone H3 do not change significantly during the meiotic time course (Supplementary Figure S3). When plotted along chromosomes, the H3K4me3 levels associated with chromatin are relatively constant at most loci during meiosis, but some loci exhibit strong temporal variation (Figure 2B). When plotted as a function of their position relative to the translational start sites of the yeast genes, H3K4me3 is maximal in the first 500 bp of ORFs, and histone H3 is depleted from promoter regions and covers ORFs uniformly (Figure 2C), as is seen in exponentially growing cells (Pokholok et al, 2005). The functional significance of these results is analysed below. Figure 2.Distribution of histone H3K4me3 during meiosis. (A) Meiotic progression of the wild-type strain (ORD7339) used for the histone H3 and H3K4me3 ChIP-chip experiments. Meiotic divisions of cells transferred to sporulation medium at t=0 h were monitored by fluorescence microscopy of 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained cells. (B) H3K4me3 distribution during wild-type meiosis along chromosome VI. Profiles are smoothed by a sliding 1 kb window computed every 250 bp. Four examples of regions where the trimethylation pattern varies are enlarged. (C) Average profiles of H3K4me3 or total histone H3 association with chromatin as a function of position relative to the translational start site. All the genes were aligned according to their start site and probes were grouped in bins of 0.2 kb. Average values for each bin are plotted for each indicated time point. Download figure Download PowerPoint Refinement of the transcriptional program of meiosis As H3K4me3 is a mark indicative of the transcriptional state of genes during vegetative growth, we first examined the relationships between trimethylation and gene expression, detected by measuring stable mRNA levels, during meiosis. As substantial discrepancies exist between previous studies of meiotic gene expression (Chu et al, 1998; Primig et al, 2000; Friedlander et al, 2006), we independently measured meiotic mRNA level patterns in our wild-type SK1 strain (Figure 3A). We identified 1074 upregulated and 723 downregulated genes, indicating that at least 29% of the genes are transcriptionally regulated during meiosis and sporulation (Figures 3B and D). A total of 85 and 86% of our up- and downregulated genes, respectively, were found in at least one of the previous meiotic regulation studies (see detailed comparisons in Supplementary Figure S4), suggesting the robustness of our list of genes. We classified our set of meiotically regulated genes into groups with similar mRNA level profiles (Supplementary data). Upregulated genes fell into 11 groups (‘up1’ to ‘up11’), with a high degree of correlation within each group (Pearson coefficient ⩾0.9) (Figure 3B, Supplementary Table S4). Downregulated genes did not cluster as discretely, but eight groups (‘down1’ to ‘down8’) were assigned (Figure 3D, Supplementary Table S5). Figure 3.Links between meiotic transcriptional gene regulation and histone H3K4 trimethylation. (A) Meiotic progression of the wild-type strain (ORD8622) used for the transcriptome analysis. The values presented are the average of the three independent time courses used to generate the transcriptome data. (B) Hierarchical clustering of the 1074 meiotically upregulated genes. Genes are grouped according to their induction pattern. The name of the clusters up1–up11 is indicated. The colour code reflects the quantitative change of expression relative to time 0 h. (C) Left panels: average expression change relative to time 0 h along meiosis for a subset of upregulated clusters. Right panels: on the 0–500 bp region of each gene of the same clusters, the average level of H3K4 trimethylation was estimated after ChIP and microarray hybridization and represented as a function of time during meiosis. (D) Hierarchical clustering of the 723 downregulated genes. Eight clusters down1–down8 are defined. Other legends as in (B). (E) Average expression changes along meiosis for a subset of downregulated genes clusters. Other legends as in (C). (F) Meiotic variations of H3K4me3 in selected meiotically induced or repressed genes. The relative expression profile obtained from the transcriptome analysis is shown for each gene for comparison (left). Quantitative measurement of H3K4me3 by qPCR (right). Enrichment values were normalized to the enrichment value of NFT1int, an internal sequence of the large NFT1 gene, used for background H3K4me3 control. Download figure Download PowerPoint Meiotic transcriptional regulation is accompanied by changes in H3K4 trimethylation To compare the temporal variation of H3K4me3 and transcription, we compared transcriptome and ChIP-chip data from cultures that showed similar kinetics of meiotic progression (Figures 2A and 3A). For each meiotically regulated gene, we calculated the mean H3K4me3 enrichment value observed in the 0–500 bp region of its coding part (Supplementary Table S6). These values were then used to compare the mean temporal mRNA level profiles with the mean trimethylation profile for each transcriptional cluster. Upregulated genes showed a net increase in H3K4 trimethylation during meiotic progression (Figures 3C and Supplementary Figure S5). A more detailed examination of the data showed that, among upregulated genes, the increase in H3K4me3 levels generally occurred after the increase in transcripts. For genes of cluster up1, which are strongly induced between times 0 and 1 h, an increase in H3K4me3 was observed at 2 h and later (Figure 3C). For most of the other clusters (up2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 and 10), we also observed an increase of H3K4me3 that was delayed relative to transcripts (Figure 3C and Supplementary Figure S5). This general pattern was confirmed by qPCR for several individual genes (Figure 3F). For the cluster up11, which contains late meiosis genes, no increase of H3K4me3 was observed. We cannot exclude the possibility that an increase occurs after 6 h, which is the last time point that we have examined. Another exception is the cluster up4, which contains the eight histone coding genes, strongly induced at the time of meiotic replication (2 h) but showing no H3K4me3 increase (Supplementary Figure S5). Within the clusters down1, 2, 4, 6 and 8 (comprising 73% of the downregulated genes), we noted that the level of H3K4me3 slowly decreases with time (Figures 3E, F and Supplementary Figure S5). This is most evident in cluster down1, in which stable mRNA levels strongly drop during the first hour, but H3K4me3 levels gradually decrease until t=6 h. Taken together, these results show at the genome-wide level that the H3K4 trimethylation is a very dynamic mark, which can be removed from chromatin upon transcription repression. By contrast, some clusters do not show altered H3K4me3 levels during repression (cluster 7, Figure 3E), showing that, in this case, decrease in the amounts of mRNA levels can occur without a substantial alteration in levels of H3K4me3. H3K4 trimethylation marks meiotic DSB sites, independently of local transcriptional levels The fact that DSB formation seems to depend on histone H3K4 methylation prompted us to investigate the pattern of H3K4me3 in the proximity of DSB sites. During the whole meiotic time course, H3K4me3 levels are higher close to the DSB sites and decrease with increasing distance from a DSB site (Figure 4A). As H3K4me3 is mainly located on the beginning of the genes, this colocalization could be due to the preferential, if not exclusive, localization of the DSBs in promoter regions (Baudat and Nicolas, 1997; Gerton et al, 2000; Blitzblau et al, 2007). This is exemplified by the fact that total H3 levels are low close to DSB sites compared with the rest of the genome (Figure 4B). To exclude a potential influence of transcription on H3K4 trimethylation variation close to DSB sites, we analysed the data as follows. First, we examined H3K4me3 levels in regions located near the 4361 genes that are neither up- or downregulated but exhibit a constant level of transcripts during meiosis (non-regulated), representing 71% of the genes. Second, to distinguish between transcription-dependent and transcription-independent levels of H3K4me3 close to DSB sites, we compared the set of the 1013 hottest DSB regions (DSB-high) with a similar set of control regions that did not display any of these hot spot DSBs (DSB-poor; Supplementary data). To avoid a strong influence of high transcription on H3K4me3 close to DSB sites, we subclassified the non-regulated genes into four quartiles, according to their average absolute transcript levels during meiosis. For this, we used another set of transcriptome data, the one from the study of Primig et al (2000), because they obtained not relative, but absolute quantitative data of transcript levels during meiosis. Within each quartile, similar transcript levels were seen for genes that are close to a DSB hot spot and genes that are not (Figure 4C, upper panels). In contrast, the level of H3K4me3 close to the DSB hot spots is very similar and ‘constitutively’ high in all quartiles, whereas in the DSB-poor regions, the average level of H3K4me3 showed a strong dependence on transcript levels and was lower than in DSB-high regions (except in the most highly transcribed quartile). The same conclusion was reached when H3K4me3 levels were normalized to total H3 levels (Supplementary Figure S6). Thus, in addition to being a mark of transcription, H3K4me3 also marks meiotic recombination initiation regions. Figure 4.DSB sites are constitutively hypertrimethylated, independently of transcript levels. (A) Average H3K4me3 as a function of the distance from the DSB sites. All the 1013 DSB hot spot sites were aligned and probes were grouped in bins of 0.5 kb. Average values for each bin are plotted for each indicated time point. (B) Average total H3 levels as a function of the distance from the DSB sites. Same legend as in (A). (C) The non-regulated genes were divided into four quartiles according to their average transcript levels during meiosis. Then DSB sites were examined in each category, both for expression levels of the adjacent genes (top panel), and for H3K4me3 (bottom panels). Profiles of control DSB-poor regions were also calculated for each quartile (dotted lines), as described in Supplementary data. Stars indicate a significant difference between DSB-high and DSB-poor regions. WT, ORD7339; spo11Y135F, ORD7341; clb5Δ clb6Δ, ORD6830. Download figure Download PowerPoint Elevated H3K4me3 levels near DSB sites are independent of replication and DSB formation To ask if the high level of H3K4me3 close to DSB sites was influenced by DSB formation, we examined the meiotic H3K4me3 profiles and transcriptomes in the spo11Y135F mutant, which is deficient in meiotic DSB formation (Bergerat et al, 1997) and progresses through meiosis to form inviable spores (Supplementary Figure S7). Patterns of meiotic transcription in wild type and spo11Y135F strains are globally similar (Supplementary Table S6 and Figure S7) and similar H3K4me3 profiles are observed in the two strains, with few exceptions, such as cluster down5 (Supplementary Figure S5). Finally, the average level of H3K4me3 is greater near DSB-high regions, independently of the absolute level of gene expression, as in wild-type cells (Figure 4C). Next, we investigated the effect of premeiotic replication by using the clb5Δ clb6Δ mutant, deficient in the premeiotic replication that normally precedes DSB formation by 2 h (Stuart and Wittenberg, 1998), and which shows no meiotic DSB formation (Smith et al, 2001). In these cells, the expression of the early genes of clusters up1–8 is not affected, and the gene clusters that are induced later in meiosis (up9–11) show reduced expression, consistent with the impairment of cell progression past MI (Supplementary Figure S7 and Table S6). H3K4me3 levels in the clb5Δ clb6Δ cells, as in WT, are greater near DSB-high regions in all expression quartiles (Figure 4C). We conclude that the H3K4me3 mark occurs preferentially near DSB sites in a manner that is independent of DSB formation and meiotic DNA replication. H3K4me3 marks natural DSB regions before entry into meiosis As meiotic replication, the major chromosomal event that precedes DSB formation, does not set the H3K4me3 difference between DSB-high and DSB-poor regions, we asked when this differential mark is established. To determine whether it pre-exists before entry into meiosis, we examined the H3K4me3 profile of a wild-type strain growing exponentially in rich medium (YPD). Remarkably, as in meiotic cells, H3K4me3 was enriched in DSB-high regions in each of the transcription quartiles, whereas in DSB-poor regions, the H3K4me3 levels co-varied with transcript levels (Figure 5, top panel). A higher H3K4me3 level was also seen for DSB sites showing a lower enrichment, between two- and five-fold over background (DSB-mild, Supplementary Figure S8). We excluded the possibility that the difference between DSB-high and DSB-poor regions was due to differences in transcript levels measured in exponentially growing cells (Holstege et al, 1998); as in meiosis, the future DSB regions are not located in the vicinity of more transcribed genes than control DSB-poor regions (Figure 5, lower panel). Therefore, H3K4me3 is a differential mark of potential meiotic recombination initiation sites that exists before the induction of meiosis. Figure 5.Hypertrimethylation of future DSB sites preexists in exponentially growing cells, and shows more RNA Polymerase II occupancy. For each of the same meiotic transcription quartiles as in Figure 4, we profiled H3K4me3 in exponentially WT growing cells (ORD7339, top panel). In the middle panel, we determined Pol II occupancy, according to published results (Steinmetz et al, 2006), close or not to DSB sites, in each quartile. The bottom panel shows, in each quartile, the transcription levels determined in exponentially growing cells (Holstege et al, 1998), close or not to a DSB site. Download figure Download PowerPoint Higher RNA polymerase II occupancy in DSB regions As high levels of H3K4me3 pre-exist in DSB regions located near low mRNA abundance genes (first quartile, Figure 4C, top panel), we wondered whether the H3K4me3 mark might be nevertheless deposited by RNA polymerase II, but without giving rise to detectable coding transcripts. We therefore compared the Pol II occupancy (Steinmetz et al, 2006) in our sets of DSB and DSB-poor regions as a function of transcription quartile. Intriguingly, in the two lowest mRNA-abundance quartiles, we found a highly significant (both P<10−5) increase in Pol II occupancy in DSB regions than in equivalent DSB-poor regions (Figure 5, middle panel). This may be the source of chromatin events leaving the H3K4me3 mark (see Discussion). H3K4me3 preferentially marks regions where DSB can be targeted The formation of meiotic DSBs in some normally DSB-poor chromosomal regions can be stimulated by the forced recruitment of a Gal4BD–Spo11 fusion protein to naturally occurring Gal4-binding sequences. These regions are defined as ‘targetable’. In contrast, in other regions, the binding of Gal4BD–Spo11 is not sufficient to trigger DSB formation, and these regions are called ‘refractory’ (Robine et al, 2007). QQR–Spo11 is another fusion of Spo11 to three artificial zinc fingers targeting DSBs in other regions than Gal4BD–Spo11. We compared the levels of H3K4me3 in the set of natural, targetable and refractory DSB regions, identified in ChIP-chip analyses of DSB formation in wild-type, Gal4BD–Spo11 and QQR–Spo11 cells (Robine et al, 2007, Uematsu et

Piwi-interacting RNAs (piRNAs) are approximately 24-30 nucleotide regulatory RNAs that are abundant in animal gonads and early embryos. The best-characterized piRNAs mediate a conserved pathway that restricts transposable elements, and these frequently engage a "ping-pong" amplification loop. Certain stages of mammalian testis also accumulate abundant piRNAs of unknown function, which derive from noncoding RNAs that are depleted in transposable element content and do not engage in ping-pong.We report that the 3' untranslated regions (3'UTRs) of an extensive set of messenger RNAs (mRNAs) are processed into piRNAs in Drosophila ovaries, murine testes, and Xenopus eggs. Analysis of different mutants and Piwi-class immunoprecipitates indicates that their biogenesis depends on primary piRNA components, but not most ping-pong components. Several observations suggest that mRNAs are actively selected for piRNA production for regulatory purposes. First, genic piRNAs do not accumulate in proportion to the level of their host transcripts, and many highly expressed transcripts lack piRNAs. Second, piRNA-producing mRNAs in Drosophila and mouse are enriched for specific gene ontology categories distinct from those of simply abundant transcripts. Third, the protein output of traffic jam, whose 3'UTR generates abundant piRNAs, is increased in piwi mutant follicle clones.We reveal a conserved primary piRNA pathway that selects and metabolizes the 3'UTRs of a broad set of cellular transcripts, probably for regulatory purposes. These findings strongly increase the breadth of Argonaute-mediated small RNA systems in metazoans.

Anti-tumor immunity is driven by self versus non-self discrimination. Many immunotherapeutic approaches to cancer have taken advantage of tumor neoantigens derived from somatic mutations. Here, we demonstrate that gene fusions are a source of immunogenic neoantigens that can mediate responses to immunotherapy. We identified an exceptional responder with metastatic head and neck cancer who experienced a complete response to immune checkpoint inhibitor therapy, despite a low mutational load and minimal pre-treatment immune infiltration in the tumor. Using whole-genome sequencing and RNA sequencing, we identified a novel gene fusion and demonstrated that it produces a neoantigen that can specifically elicit a host cytotoxic T cell response. In a cohort of head and neck tumors with low mutation burden, minimal immune infiltration and prevalent gene fusions, we also identified gene fusion-derived neoantigens that generate cytotoxic T cell responses. Finally, analyzing additional datasets of fusion-positive cancers, including checkpoint-inhibitor-treated tumors, we found evidence of immune surveillance resulting in negative selective pressure against gene fusion-derived neoantigens. These findings highlight an important class of tumor-specific antigens and have implications for targeting gene fusion events in cancers that would otherwise be less poised for response to immunotherapy, including cancers with low mutational load and minimal immune infiltration.

In many areas of oncology, we lack sensitive tools to track low-burden disease. Although cell-free DNA (cfDNA) shows promise in detecting cancer mutations, we found that the combination of low tumor fraction (TF) and limited number of DNA fragments restricts low-disease-burden monitoring through the prevailing deep targeted sequencing paradigm. We reasoned that breadth may supplant depth of sequencing to overcome the barrier of cfDNA abundance. Whole-genome sequencing (WGS) of cfDNA allowed ultra-sensitive detection, capitalizing on the cumulative signal of thousands of somatic mutations observed in solid malignancies, with TF detection sensitivity as low as 10−5. The WGS approach enabled dynamic tumor burden tracking and postoperative residual disease detection, associated with adverse outcome. Thus, we present an orthogonal framework for cfDNA cancer monitoring via genome-wide mutational integration, enabling ultra-sensitive detection, overcoming the limitation of cfDNA abundance and empowering treatment optimization in low-disease-burden oncology care. A new approach for whole-genome sequencing of plasma circulating tumor DNA allows for dynamic monitoring of disease burden and ultra-sensitive detection of minimal residual disease.