By the onset of morphogenesis, Drosophila embryos consist of about 6000 cells that express distinct gene combinations. Here, we used single-cell sequencing of precisely staged embryos and devised DistMap, a computational mapping strategy to reconstruct the embryo and to predict spatial gene expression approaching single-cell resolution. We produced a virtual embryo with about 8000 expressed genes per cell. Our interactive Drosophila Virtual Expression eXplorer (DVEX) database generates three-dimensional virtual in situ hybridizations and computes gene expression gradients. We used DVEX to uncover patterned expression of transcription factors and long noncoding RNAs, as well as signaling pathway components. Spatial regulation of Hippo signaling during early embryogenesis suggests a mechanism for establishing asynchronous cell proliferation. Our approach is suitable to generate transcriptomic blueprints for other complex tissues.

Organoids generated from human pluripotent stem cells (PSCs) provide experimental systems to study development and disease. However, we lack quantitative spatiotemporal descriptions of organoid development that incorporate measurements across different molecular modalities. Here we focus on the retina and use a single-cell multimodal approach to reconstruct human retinal organoid development. We establish an experimental and computational pipeline to generate multiplexed spatial protein maps over a retinal organoid time course and primary adult human retina, registering protein expression features at the population, cellular, and subcellular levels. We develop an analytical toolkit to segment nuclei, identify local and global tissue units, infer morphology trajectories, and analyze cell neighborhoods from multiplexed imaging data. We use this toolkit to visualize progenitor and neuron location, the spatial arrangements of extracellular and subcellular components, and global patterning in each organoid and primary tissue. In addition, we generate a single-cell transcriptome and chromatin accessibility time course dataset and infer a gene regulatory network underlying organoid development. We then integrate genomic data with spatially segmented nuclei into a multi-modal atlas enabling virtual exploration of retinal organoid development. We visualize molecular, cellular, and regulatory dynamics during organoid lamination, and identify regulons associated with neuronal differentiation and maintenance. We use the integrated atlas to explore retinal ganglion cell (RGC) spatial neighborhoods, highlighting pathways involved in RGC cell death. Finally, we show that mosaic CRISPR/Cas genetic perturbations in retinal organoids provide insight into cell fate regulation. Altogether, our work is a major advance toward a virtual human retinal organoid, and provides new directions for how to approach disorders of the visual system. More broadly, our approaches can be adapted to many organoid systems.

ABSTRACT Background Recent developments in droplet-based microfluidics allow the transcriptional profiling of thousands of individual cells, in a quantitative, highly parallel and cost-effective way. A critical, often limiting step is the preparation of cells in an unperturbed state, not compromised by stress or ageing. Another challenge are rare cells that need to be collected over several days, or samples prepared at different times or locations. Results Here, we used chemical fixation to overcome these problems. Methanol fixation allowed us to stabilize and preserve dissociated cells for weeks. By using mixtures of fixed human and mouse cells, we showed that individual transcriptomes could be confidently assigned to one of the two species. Single-cell gene expression from live and fixed samples correlated well with bulk mRNA-seq data. We then applied methanol fixation to transcriptionally profile primary single cells from dissociated complex tissues. Low RNA content cells from Drosophila embryos, as well as mouse hindbrain and cerebellum cells sorted by FACS, were successfully analysed after fixation, storage and single-cell droplet RNA-seq. We were able to identify diverse cell populations, including neuronal subtypes. As an additional resource, we provide ‘dropbead’, an R package for exploratory data analysis, visualization and filtering of Drop-seq data. Conclusions We expect that the availability of a simple cell fixation method will open up many new opportunities in diverse biological contexts to analyse transcriptional dynamics at single cell resolution.

ABSTRACT Drosophila is a premier model system for understanding the molecular mechanisms of development. By the onset of morphogenesis, ~6000 cells express distinct gene combinations according to embryonic position. Despite extensive mRNA in situ screens, combinatorial gene expression within individual cells is largely unknown. Therefore, it is difficult to comprehensively identify the coding and non-coding transcripts that drive patterning and to decipher the molecular basis of cellular identity. Here, we single-cell sequence precisely staged embryos, measuring >3100 genes per cell. We produce a ‘transcriptomic blueprint’ of development – a virtual embryo where 3D locations of sequenced cells are confidently identified. Our “ D rosophila - V irtual- E xpression-e X plorer” performs virtual in situ hybridizations and computes expression gradients. Using DVEX, we predict spatial expression and discover patterned lncRNAs. DEVX is sensitive enough to detect subtle evolutionary changes in expression patterns between Drosophila species. We believe DVEX is a prototype for powerful single cell studies in complex tissues.

Abstract The liver has the remarkable capacity to regenerate. In the clinic, regeneration is induced by portal vein embolization, which redirects portal blood flow, resulting in liver hypertrophy in locations with increased blood supply, and atrophy of embolized segments. Here, we apply single-cell and single-nucleus transcriptomics on healthy, hypertrophied, and atrophied patient-derived liver samples to explore cell states in the regenerating liver. Our data unveils pervasive upregulation of genes associated with developmental processes, cellular adhesion, and inflammation in post-portal vein embolization liver, disrupted portal-central hepatocyte zonation, and altered cell subtype composition of endothelial and immune cells. Interlineage crosstalk analysis reveals mesenchymal cells as an interaction hub between immune and endothelial cells, and highlights the importance of extracellular matrix proteins in liver regeneration. Moreover, we establish tissue-scale iterative indirect immunofluorescence imaging for high-dimensional spatial analysis of perivascular microenvironments, uncovering changes to tissue architecture in regenerating liver lobules. Altogether, our data is a rich resource revealing cellular and histological changes in human liver regeneration.

Cell type specification during early nervous system development in Drosophila melanogaster requires precise regulation of gene expression in time and space. Resolving the programs driving neurogenesis has been a major challenge owing to the complexity and rapidity with which distinct cell populations arise. To resolve the cell type-specific gene expression dynamics in early nervous system development, we have sequenced the transcriptomes of purified neurogenic cell types across consecutive time points covering critical events in neurogenesis. The resulting gene expression atlas comprises a detailed resource of global transcriptome dynamics that permits systematic analysis of how cells in the nervous system acquire distinct fates. We resolve known gene expression dynamics and uncover novel expression signatures for hundreds of genes among diverse neurogenic cell types, most of which remain unstudied. We also identified a set of conserved and processed long-noncoding RNAs (lncRNAs) that exhibit spatiotemporal expression during neurogenesis with exquisite specificity. LncRNA expression is highly dynamic and demarcates specific subpopulations within neurogenic cell types. Our spatiotemporal transcriptome atlas provides a comprehensive resource to investigate the function of coding genes and noncoding RNAs during critical stages of early neurogenesis.