Significance The function of the cell membrane as a barrier and a matrix for biochemical activity relies on the properties imparted by lipids. In eukaryotes, sterols are crucial for modulating the molecular order of membranes. Sterol ordering provides the basis for membrane lateral segregation and promotes a fluid, mechanically robust plasma membrane. How do organisms that lack sterols determine membrane order? Hopanoids are bacterial membrane lipids that have been demonstrated to have sterol-like properties in vitro. We now explore the distribution of hopanoids and their effect on membranes in Methylobacterium extorquens . We find that hopanoids determine bacterial outer membrane order in a manner analogous to sterol ordering in the eukaryotic plasma membrane, and that their deletion impairs energy-dependent multidrug efflux.

Abstract Biological membranes have a stunning ability to adapt their composition in response to physiological stress and metabolic challenges. Little is known how such perturbations affect individual organelles in eukaryotic cells. Pioneering work provided insights into the subcellular distribution of lipids, but the composition of the endoplasmic reticulum (ER) membrane, which also crucially regulates lipid metabolism and the unfolded protein response, remained insufficiently characterized. Here we describe a method for purifying organellar membranes from yeast, MemPrep. We demonstrate the purity of our ER preparations by quantitative proteomics and document the general utility of MemPrep by isolating vacuolar membranes. Quantitative lipidomics establishes the lipid composition of the ER and the vacuolar membrane. Our findings have important implications for understanding the role of lipids in membrane protein insertion, folding, and their sorting along the secretory pathway. Application of the combined preparative and analytical platform to acutely stressed cells reveals dynamic ER membrane remodeling and establishes molecular fingerprints of lipid bilayer stress.

Abstract RNA is a ubiquitous biomolecule that can serve as both catalyst and information carrier. Understanding how RNA bioactivity is controlled is crucial for elucidating its physiological roles and potential applications in synthetic biology. Here we show that lipid membranes can act as RNA organization platforms, introducing a novel mechanism for ribo-regulation. The activity of R3C ribozyme can be modified by the presence of lipid membranes, with direct RNA-lipid interactions dependent on RNA nucleotide content, base pairing and length. In particular, the presence of guanine in short RNAs is crucial for RNA-lipid interactions, and G-quadruplex formation further promotes lipid binding. Lastly, by artificially modifying the R3C substrate sequence to enhance membrane binding we generated a lipid-sensitive ribozyme reaction with riboswitch-like behavior. These findings introduce RNA-lipid interactions as a tool for developing synthetic riboswitches and novel RNA-based lipid biosensors, and bear significant implications for RNA World scenarios for the origin of life.

Abstract Hopanoids and carotenoids are two of the major isoprenoid-derived lipid classes in prokaryotes that have been proposed to have similar membrane ordering properties as sterols. Methylobacterium extorquens contains hopanoids and carotenoids in their outer membrane, making them an ideal system to investigate whether isoprenoid lipids play a complementary role in outer membrane ordering and cellular fitness. By genetically knocking out hpnE , and crtB we disrupted the production of squalene, and phytoene in Methylobacterium extorquens PA1, which are the presumed precursors for hopanoids and carotenoids, respectively. Deletion of hpnE unexpectedly revealed that carotenoid biosynthesis utilizes squalene as a precursor resulting in a pigmentation with a C 30 backbone, rather than the previously predicted C 40 phytoene-derived pathway. We demonstrate that hopanoids but not carotenoids are essential for growth at high temperature. However, disruption of either carotenoid or hopanoid synthesis leads to opposing effects on outer membrane lipid packing. These observations show that hopanoids and carotenoids may serve complementary biophysical roles in the outer membrane. Phylogenetic analysis suggests that M. extorquens may have acquired the C 30 pathway through lateral gene transfer with Planctomycetes. This suggests that the C 30 carotenoid pathway may have provided an evolutionary advantage to M. extorquens . Importance All cells have a membrane that delineates the boundary between life and its environment. To function properly, membranes must maintain a delicate balance of physical and chemical properties. Lipids play a crucial role in tuning membrane properties. In eukaryotic organisms from yeast to mammals, sterols are essential for assembling a cell surface membrane that can support life. However, bacteria generally do not make sterols, so how do they solve this problem? Hopanoids and carotenoids are two major bacterial lipids, that are proposed as sterol surrogates. In this study we explore the bacterium M. extorquens for studying the role of hopanoids and carotenoids in surface membrane properties and cellular growth. Our findings suggest that hopanoids and carotenoids may serve complementary roles balancing outer membrane properties, and provide a foundation for elucidating the principles of surface membrane adaptation.

Cell membranes mediate interactions between life and its environment, with lipids determining their properties. Understanding how cells adjust their lipidomes to tune membrane properties is crucial yet poorly defined due to the complexity of most organisms. We used quantitative shotgun lipidomics to study temperature adaptation in the simple organism Mycoplasma mycoides and the minimal cell JCVI-syn3B. We show that lipid abundances follow a universal logarithmic distribution across eukaryotes and bacteria, with comparable degrees of lipid remodeling for adaptation regardless of lipidomic or organismal complexity. Lipid features analysis demonstrates head-group-specific acyl chain remodeling as characteristic of lipidome adaptation; its deficiency in Syn3B is associated with impaired homeoviscous adaptation. Temporal analysis reveals a two-stage cold adaptation process: swift cholesterol and cardiolipin shifts followed by gradual acyl chain modifications. This work provides an in-depth analysis of lipidome adaptation in minimal cells, laying a foundation to probe the design principles of living membranes.

RNA plays crucial roles in cellular organization and metabolism, and modulating its activity is essential for maintaining cellular functions. RNA activity, involving both catalytic (ribozymes) and translation processes, is controlled via myriad mechanisms involving different binding partners such as proteins and smaller polar solutes. We previously reported that lipid membranes can directly interact with the artificial R3C ribozyme, changing its activity; however, the effect of lipids on naturally occurring ribozymes remains unknown. Here, we report that both catalytic activity and RNA integrity can be controlled by the presence of different lipid membranes. Lipid gel membranes decreased the activity of hepatitis delta virus (HDV) and increased the hammerhead (HH) ribozyme reaction yield. The presence of lipid liquid membrane lattices triggered RNA degradation, with greater degradation occurring in the single-stranded regions of RNA. The interplay between RNA activity and stability in the presence of different lipid membranes introduces multiple possibilities, where different combinations of ribozyme and lipid membrane composition could produce different effects on activity. Taken together, these observations support the hypothesis that the activity of both natural and artificial RNAs can be modulated by lipid membranes, which, in turn, contribute to the development of novel riboswitch-like molecules and lipid membrane-based RNA-biosensors.

Abstract Climate change poses a threat to soil health and agriculture, but the potential effects of climate change on soil bacteria that can help maintain soil health are understudied. Rhizobia are a group of bacteria that increase soil nitrogen content through a symbiosis with legume plants. The soil and symbiosis are potentially stressful environments, and the soil will likely become even more stressful as the climate changes. Many rhizobia within the bradyrhizobia clade, like Bradyrhizobium diazoefficiens , possess the genetic capacity to synthesize hopanoids, steroid-like lipids similar in structure and function to cholesterol. Hopanoids are known to protect against stresses relevant to the niche of B. diazoefficiens . Paradoxically, mutants unable to synthesize the extended class of hopanoids participate in similarly successful symbioses compared to the wild type, despite being delayed in root nodule initiation. Here, we show that in B. diazoefficiens , the in vitro growth defects of extended hopanoid deficient mutants can be at least partially compensated for by the physicochemical environment, specifically by optimal osmotic and divalent cation concentrations. Through biophysical measurements, we show that extended hopanoids confer robustness to environmental variability. These results help explain the discrepancy between previous in vitro and in planta results and indicate that hopanoids may provide a greater fitness advantage to rhizobia in the variable soil environment than the more controlled environment within root nodules. To improve the legume-rhizobia symbiosis through either bioengineering or strain selection, it will be important to consider the full lifecycle of rhizobia, from the soil to the symbiosis. Importance Rhizobia, such as B. diazoefficiens , play an important role in the nitrogen cycle by making nitrogen gas bioavailable through symbiosis with legume plants. As climate change threatens soil health, this symbiosis has reentered the spotlight as a more sustainable source of soil nitrogen than the energy-intensive Haber-Bosch process. Efforts to use rhizobia as biofertilizers have been effective; however, long term integration of rhizobia into the soil community has been less successful. This work represents a small step towards improving the legume-rhizobia symbiosis by identifying a cellular component—hopanoid lipids—that confers robustness to environmental stresses rhizobia are likely to encounter in soil microenvironments as sporadic desiccation and flooding events become more common.

The cell membrane must balance mechanical stability with fluidity to function as both a barrier and an organizational platform. Key to this balance is the ordering of hydrocarbon chains and the packing of lipids. Many eukaryotes synthesize sterols, which are uniquely capable of modulating the lipid order to decouple membrane stability from fluidity. Ancient sterol analogs known as hopanoids are found in many bacteria and proposed as ancestral ordering lipids. The juxtaposition of sterols and hopanoids in extant organisms prompts us to ask why both pathways persist, especially in light of their convergent ability to order lipids. In this work, simulations, monolayer experiments, and cellular assays show that hopanoids and sterols order unsaturated phospholipids differently based on the position of double bonds in the phospholipid acyl chain. We find that cholesterol and diplopterol's methyl group distributions lead to distinct effects on unsaturated lipids. In Mesoplasma florum, diplopterol's constrained ordering capacity reduces membrane resistance to osmotic stress, unlike cholesterol. These findings suggest that cholesterol's broader lipid-ordering ability may have facilitated the exploration of a more diverse lipidomic landscape in eukaryotic membranes.

In order to unravel the underlying principles of membrane adaptation in small systems like bacterial cells, robust approaches to characterize membrane fluidity are needed. Currently available relevant methods require advanced instrumentation and are not suitable for high throughput settings needed to elucidate the biochemical pathways involved in adaptation. We developed a fast, robust, and financially accessible quantitative method to measure microviscosity of lipid membranes in bulk suspension using a commercially available plate reader. Our approach, which is suitable for high-throughput screening, is based on the simultaneous measurements of absorbance and fluorescence emission of a viscosity-sensitive fluorescent dye DCVJ incorporated into a lipid membrane. We validated our method using artificial membranes with various lipid compositions over a range of temperatures and observed values that were in good agreement with previously published results. Using our approach, we were able to detect a lipid phase transition in the ruminant pathogen Mycoplasma mycoides .

All cells are encapsulated by a lipid membrane which facilitates the interaction between life and its environment. How life exploits the diverse mixtures of lipids that dictate membrane property and function has been experimentally challenging to address. We introduce an approach to tune and minimize lipidomes in Mycoplasma mycoides and the Minimal Cell (JCVI-Syn3A) revealing that a 2-component lipidome can support life. Systematically reintroducing phospholipid features demonstrated that acyl chain diversity is more critical for growth than head group diversity. By tuning lipid chirality, we explored the lipid divide between Archaea and the rest of life, showing that ancestral lipidomes could have been heterochiral. Our approach offers a tuneable minimal membrane system to explore the role of lipid complexity, opening new directions in bioengineering.