The exploration of copy-number variation (CNV), notably of somatic cells, is an understudied aspect of genome biology. Any differences in the genetic makeup between twins derived from the same zygote represent an irrefutable example of somatic mosaicism. We studied 19 pairs of monozygotic twins with either concordant or discordant phenotype by using two platforms for genome-wide CNV analyses and showed that CNVs exist within pairs in both groups. These findings have an impact on our views of genotypic and phenotypic diversity in monozygotic twins and suggest that CNV analysis in phenotypically discordant monozygotic twins may provide a powerful tool for identifying disease-predisposition loci. Our results also imply that caution should be exercised when interpreting disease causality of de novo CNVs found in patients based on analysis of a single tissue in routine disease-related DNA diagnostics. The exploration of copy-number variation (CNV), notably of somatic cells, is an understudied aspect of genome biology. Any differences in the genetic makeup between twins derived from the same zygote represent an irrefutable example of somatic mosaicism. We studied 19 pairs of monozygotic twins with either concordant or discordant phenotype by using two platforms for genome-wide CNV analyses and showed that CNVs exist within pairs in both groups. These findings have an impact on our views of genotypic and phenotypic diversity in monozygotic twins and suggest that CNV analysis in phenotypically discordant monozygotic twins may provide a powerful tool for identifying disease-predisposition loci. Our results also imply that caution should be exercised when interpreting disease causality of de novo CNVs found in patients based on analysis of a single tissue in routine disease-related DNA diagnostics. Monozygotic (MZ) twins represent an important resource in genetic studies related to normal development and disease. Numerous twin registries exist,1Busjahn A. Hur Y.M. Twin registries: An ongoing success story.Twin Res. Hum. Genet. 2006; 9: 705Crossref PubMed Google Scholar often specializing in collection of phenotypically discordant MZ twins. Consequently, twin research has become a powerful tool for studying various diseases and endophenotypes, evaluating quantitative-trait loci, estimating heritability, studying differences in gene expression, and testing hypotheses regarding gene-environment interactions.1Busjahn A. Hur Y.M. Twin registries: An ongoing success story.Twin Res. Hum. Genet. 2006; 9: 705Crossref PubMed Google Scholar It is generally presumed that MZ twins are genetically identical and that phenotypic differences between twins are mainly due to environmental factors. Examples of genetic and, more recently, epigenetic differences between MZ twins have, however, been described.2Machin G.A. Some causes of genotypic and phenotypic discordance in monozygotic twin pairs.Am. J. Med. Genet. 1996; 61: 216-228Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar, 3Gringras P. Chen W. Mechanisms for differences in monozygous twins.Early Hum. Dev. 2001; 64: 105-117Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (72) Google Scholar, 4Fraga M.F. Ballestar E. Paz M.F. Ropero S. Setien F. Ballestar M.L. Heine-Suner D. Cigudosa J.C. Urioste M. Benitez J. et al.Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 10604-10609Crossref PubMed Scopus (2435) Google Scholar, 5Petronis A. Epigenetics and twins: Three variations on the theme.Trends Genet. 2006; 22: 347-350Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (158) Google Scholar The former are mainly related to aneuploidies. Somatic mosaicism is usually defined by the presence of genetically distinct populations of somatic cells in a single organism. Any genetic difference between MZ twins represents an extreme example of somatic mosaicism. Earlier reports have shown somatic mosaicism for mutations in specific disease-related genes or chromosomal aberrations that are connected with a disease and can, for instance, result in a milder disease phenotype.6Gratacos M. Nadal M. Martin-Santos R. Pujana M.A. Gago J. Peral B. Armengol L. Ponsa I. Miro R. Bulbena A. et al.A polymorphic genomic duplication on human chromosome 15 is a susceptibility factor for panic and phobic disorders.Cell. 2001; 106: 367-379Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (174) Google Scholar, 7Youssoufian H. Pyeritz R.E. Mechanisms and consequences of somatic mosaicism in humans.Nat. Rev. Genet. 2002; 3: 748-758Crossref PubMed Scopus (272) Google Scholar, 8Erickson R.P. Somatic gene mutation and human disease other than cancer.Mutat. Res. 2003; 543: 125-136Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar, 9Gollob M.H. Jones D.L. Krahn A.D. Danis L. Gong X.Q. Shao Q. Liu X. Veinot J.P. Tang A.S. Stewart A.F. et al.Somatic mutations in the connexin 40 gene (GJA5) in atrial fibrillation.N. Engl. J. Med. 2006; 354: 2677-2688Crossref PubMed Scopus (421) Google Scholar This steadily growing body of data indicates that somatic mosaicism for pathogenic mutations affecting known disease genes might be seen as a rule rather than as an exception. In addition, it was recently demonstrated that the frequency of inversions is altered between different populations of normal somatic cells in a healthy subject.10Flores M. Morales L. Gonzaga-Jauregui C. Dominguez-Vidana R. Zepeda C. Yanez O. Gutierrez M. Lemus T. Valle D. Avila M.C. et al.Recurrent DNA inversion rearrangements in the human genome.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104: 6099-6106Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar However, the frequency of in vivo somatic mosaicism for copy-number variations (CNVs) in populations of apparently normal cells is so far unexplored. A recent and important development in human genetics is the discovery of substantial large-scale structural variation (SV) changing the chromosomal architecture (such as deletions, duplications, insertions, inversions, and more complex rearrangements) and occurring both in phenotypically normal and in diseased subjects. The most explored subtype of SV involves changes affecting copy number of DNA segments (denoted here as Copy-Number Variation, [CNV]), often involving fragments of chromosomes that are considerable in size. Although approximately three years have passed since the initial reports,11Sebat J. Lakshmi B. Troge J. Alexander J. Young J. Lundin P. Maner S. Massa H. Walker M. Chi M. et al.Large-scale copy number polymorphism in the human genome.Science. 2004; 305: 525-528Crossref PubMed Scopus (1899) Google Scholar, 12Iafrate A.J. Feuk L. Rivera M.N. Listewnik M.L. Donahoe P.K. Qi Y. Scherer S.W. Lee C. Detection of large-scale variation in the human genome.Nat. Genet. 2004; 36: 949-951Crossref PubMed Scopus (2232) Google Scholar current publications still suggest that CNV is an underestimated aspect of the human genome in health and disease.13Sebat J. Major changes in our DNA lead to major changes in our thinking.Nat. Genet. 2007; 39: s3-s5Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar In one comprehensive recent study,14Redon R. Ishikawa S. Fitch K.R. Feuk L. Perry G.H. Andrews T.D. Fiegler H. Shapero M.H. Carson A.R. Chen W. et al.Global variation in copy number in the human genome.Nature. 2006; 444: 444-454Crossref PubMed Scopus (3066) Google Scholar it has been suggested that the total amount of sequence variation involving CNVs between two normal subjects is actually higher than that for single-nucleotide polymorphisms (SNPs). This conclusion has been reinforced by the recent increase in resolution of CNV discovery.15Korbel J.O. Urban A.E. Affourtit J.P. Godwin B. Grubert F. Simons J.F. Kim P.M. Palejev D. Carriero N.J. Du L. et al.Paired-End Mapping Reveals Extensive Structural Variation in the Human Genome.Science. 2007; 318: 420-426Crossref PubMed Scopus (848) Google Scholar The advent of massively parallel sequencing will soon bridge the remaining gap between efficient global analysis of SNPs and assessments of SVs, so that in the next few years we will be able to fully explore the “SV plasticity” of our genome and its relation to normal and pathogenic variation. The rationale of this study was to test whether phenotypically unselected and concordant MZ twins, as well as selected MZ twins discordant for a neurodegenerative phenotype, display CNVs. We used two different genome-wide platforms—the 32K BAC array and the Illumina HumanHap 300 Duo beadchip system—for cross-validation of the most salient findings. We present evidence for large-scale CNVs among MZ twins and suggest that these variations may be common, notably in somatic development. Our results question the long-standing notion that MZ twins are essentially genetically identical and open up new possibilities in the use of discordant MZ twins for identifying regions harboring disease- or trait-influencing loci. Arrays constructed with genomic clones are widely used as a tool for CNV detection.14Redon R. Ishikawa S. Fitch K.R. Feuk L. Perry G.H. Andrews T.D. Fiegler H. Shapero M.H. Carson A.R. Chen W. et al.Global variation in copy number in the human genome.Nature. 2006; 444: 444-454Crossref PubMed Scopus (3066) Google Scholar, 16Buckley P.G. Mantripragada K.K. Benetkiewicz M. Tapia-Páez I. Diaz de Ståhl T. Rosenquist M. Ali H. Jarbo C. de Bustos C. Hirvelä C. et al.A full-coverage, high-resolution human chromosome 22 genomic microarray for clinical and research applications.Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 3221-3229Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar, 17Ishkanian A.S. Malloff C.A. Watson S.K. DeLeeuw R.J. Chi B. Coe B.P. Snijders A. Albertson D.G. Pinkel D. Marra M.A. et al.A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome.Nat. Genet. 2004; 36: 299-303Crossref PubMed Scopus (525) Google Scholar, 18Wong K.K. deLeeuw R.J. Dosanjh N.S. Kimm L.R. Cheng Z. Horsman D.E. MacAulay C. Ng R.T. Brown C.J. Eichler E.E. et al.A comprehensive analysis of common copy-number variations in the human genome.Am. J. Hum. Genet. 2007; 80: 91-104Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (395) Google Scholar The 32K BAC-array platform is a sensitive system to assess subtle imbalances and has been validated by use of a large number of samples with known genotypes. The samples used in this study were hybridized to the 32K BAC array and washed and scanned according to previously published protocols.19Diaz de Ståhl T. Sandgren J. Piotrowski A. Nord H. Andersson R. Menzel U. Bogdan A. Thuresson A.-C. Poplawski A. von Tell D. et al.Profiling of copy number variations (CNVs) in healthy individuals in three ethnic groups using a human genome 32K BAC-clone-based array.Hum. Mutat. 2007; (in press)Google Scholar All hybridizations were done in duplicate, with the dyes being swapped between the twins in the second hybridization to eliminate a possible dye-specific bias. The results were deposited in and analyzed with the Linnaeus Centre for Bioinformatics (LCB) environment for microarray-data management.20Ameur A. Yankovski V. Enroth S. Spjuth O. Komorowski J. The LCB Data Warehouse.Bioinformatics. 2006; 22: 1024-1026Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar Here, nonoptimal array features were filtered out, and spatial artifacts were addressed with the use of print-tip loess normalization.19Diaz de Ståhl T. Sandgren J. Piotrowski A. Nord H. Andersson R. Menzel U. Bogdan A. Thuresson A.-C. Poplawski A. von Tell D. et al.Profiling of copy number variations (CNVs) in healthy individuals in three ethnic groups using a human genome 32K BAC-clone-based array.Hum. Mutat. 2007; (in press)Google Scholar Comparative analysis was done in Microsoft Excel. Here, we excluded all clones that were not reliably scored in both hybridizations for each twin. We then calculated the global standard deviation (SD) of the remaining clones. Clones with an internal SD larger than the global SD were excluded for further analysis. Finally, we performed a t test to test whether the clones from the two duplicated experiments deviated significantly from the value of one, which is the theoretical value for a normal copy-number ratio. Computational analysis of statistical significance was carried out with the R statistical computing environment.21R Development Core TeamR: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria2006Google Scholar We further applied the SNP-based Illumina HumanHap 300 Duo beadchip, which can also be used for copy-number analysis.22Peiffer D.A. Le J.M. Steemers F.J. Chang W. Jenniges T. Garcia F. Haden K. Li J. Shaw C.A. Belmont J. et al.High-resolution genomic profiling of chromosomal aberrations using Infinium whole-genome genotyping.Genome Res. 2006; 16: 1136-1148Crossref PubMed Scopus (389) Google Scholar The Illumina hybridizations were performed at the Leiden Genome Technology Center according to the manufacturer's instructions (Illumina, San Diego, CA). Image analysis was performed in Illumina's BeadStudio software, and the raw data were exported into Microsoft Access. Here, we filtered out all data that had allele frequency values representing homozygous SNPs. The absolute difference of the remaining heterozygous SNPs between the twins in each twin pair was then calculated and plotted. The data were finally deposited at the GEO main page at NCBI under the accession number GSE9609. We studied a total of 19 pairs of MZ twins by using peripheral-blood-derived DNA (Table S1, available online). Nine MZ twin pairs were previously collected and assessed for Parkinson disease (PD [MIM 168600]), parkinsonism [MIM 168600], or Lewy body dementia [MIM 127750] by the Swedish Twin Registry (STR).23Lichtenstein P. De Faire U. Floderus B. Svartengren M. Svedberg P. Pedersen N.L. The Swedish Twin Registry: A unique resource for clinical, epidemiological and genetic studies.J. Intern. Med. 2002; 252: 184-205Crossref PubMed Scopus (502) Google Scholar, 24Wirdefeldt K. Gatz M. Bakaysa S. Fiske A. Flensburg M. Petzinger G. Widner H. Lew M. Welsh M. Pedersen N. Complete ascertainment of Parkinson disease in the Swedish Twin Registry.Neurobiol. Aging. 2007; (in press)PubMed Google Scholar Six of these nine MZ twin pairs were discordant for probable or possible PD, two pairs were discordant for parkinsonism of unknown cause, and one pair was discordant for Lewy body dementia. In two of the six MZ twin pairs discordant for PD, the co-twin had essential tremor, and in one pair, the co-twin had a mixed form of parkinsonism (Table S1). Ten phenotypically unselected and concordant normal Dutch MZ twins were collected as part of the Netherlands Twin Register (NTR).25Boomsma D.I. de Geus E.J. Vink J.M. Stubbe J.H. Distel M.A. Hottenga J.J. Posthuma D. van Beijsterveldt T.C. Hudziak J.J. Bartels M. et al.Netherlands Twin Register: From twins to twin families.Twin Res. Hum. Genet. 2006; 9: 849-857Crossref PubMed Google Scholar The monozygosity of the STR twins was determined on the basis of questionnaires, which alone have a 98% probability of correct zygosity establishment,23Lichtenstein P. De Faire U. Floderus B. Svartengren M. Svedberg P. Pedersen N.L. The Swedish Twin Registry: A unique resource for clinical, epidemiological and genetic studies.J. Intern. Med. 2002; 252: 184-205Crossref PubMed Scopus (502) Google Scholar and was further confirmed by genotyping with 13–18 SNPs distributed throughout the genome. On the basis of allele frequencies from 249 control subjects,26Elbaz A. Nelson L.M. Payami H. Ioannidis J.P. Fiske B.K. Annesi G. Carmine Belin A. Factor S.A. Ferrarese C. Hadjigeorgiou G.M. et al.Lack of replication of thirteen single-nucleotide polymorphisms implicated in Parkinson's disease: A large-scale international study.Lancet Neurol. 2006; 5: 917-923Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (76) Google Scholar the probability of being concordant at that number of unlinked loci, assuming dizygosity, was less than 0.03 (Table S1 and data not shown). The ten NTR MZ twins were genotyped on the SNP beadchip containing more than 300,000 SNPs, and genotypes were concordant for all SNPs. The primary platform for analysis of STR twin pairs was the 32K BAC array. We compared one twin versus its co-twin and each twin against a genetically well-characterized normal female control (F1).19Diaz de Ståhl T. Sandgren J. Piotrowski A. Nord H. Andersson R. Menzel U. Bogdan A. Thuresson A.-C. Poplawski A. von Tell D. et al.Profiling of copy number variations (CNVs) in healthy individuals in three ethnic groups using a human genome 32K BAC-clone-based array.Hum. Mutat. 2007; (in press)Google Scholar The latter comparison serves to assess the true genotype of the twins (i.e., presence of putative shared CNV), whereas the former experiments show putative imbalance within each twin pair. BAC-array profiles from experiments between any twin versus F1 are consistently noisier, with higher standard deviations, compared to experiments using DNA from one twin versus another from the same pair (not shown). Comparisons within the STR twin pairs revealed a considerable number of loci suggestive of putative CNV. For instance, the profile from twin pair 291/292 points to a deletion encompassing 22 Mb of 11q in subject 292 on the basis of profiles from seven experiments (Figure 1). This finding was confirmed and refined on the Illumina beadchip (Figure 1). The centromeric breakpoint of the 22 Mb deletion, located at ∼102 Mb, overlaps with a known intrachromosomal segmental duplication, and this deletion encompasses the ATM gene [MIM 607585] (see below). Comparing the BAC-array ratios with experiments in which all cells are affected by an imbalance (e.g., ratios for chromosome X in hybridization of male versus female), we estimated that the deletion in twin 292 is present in ∼20% of nucleated blood cells.16Buckley P.G. Mantripragada K.K. Benetkiewicz M. Tapia-Páez I. Diaz de Ståhl T. Rosenquist M. Ali H. Jarbo C. de Bustos C. Hirvelä C. et al.A full-coverage, high-resolution human chromosome 22 genomic microarray for clinical and research applications.Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 3221-3229Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar We also confirmed this CNV in quintuple in a high-resolution, repeat-free, nonredundant, PCR-based array (Figure 1), a test we previously developed for the detection of pathogenic gains and deletions and the discovery of CNV.27Mantripragada K.K. Buckley P.G. Jarbo C. Menzel U. Dumanski J.P. Development of NF2 gene specific, strictly sequence defined diagnostic microarray for deletion detection.J. Mol. Med. 2003; 81: 443-451Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar, 28Mantripragada K.K. Thuresson A.C. Piotrowski A. Diaz de Stahl T. Menzel U. Grigelionis G. Ferner R.E. Griffiths S. Bolund L. Mautner V. et al.Identification of novel deletion breakpoints bordered by segmental duplications in the NF1 locus using high resolution array-CGH.J. Med. Genet. 2006; 43: 28-38Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 29de Bustos C. Diaz de Stahl T. Piotrowski A. Mantripragada K.K. Buckley P.G. Darai E. Hansson C.M. Grigelionis G. Menzel U. Dumanski J.P. Analysis of copy number variation in the normal human population within a region containing complex segmental duplications on 22q11 using high-resolution array-CGH.Genomics. 2006; 88: 152-162Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar Details regarding this confirmatory array are available from the authors upon request. In addition to the 11q rearrangement, another large deletion, affecting 4p and a considerable part of 4q, was found in twin 292 by both 32K BAC analysis and Illumina beadchip (Figure 1). This ∼85 Mb deletion was present in ∼10–15% of cells. On the basis of the striking conjunction of two very large deletions, we searched the literature and found that chromosome 4 deletion and an 11q deletion, which targets the ATM gene, are common for chronic lymphocytic leukemia (CLL [MIM 151400]).30Summersgill B. Thornton P. Atkinson S. Matutes E. Shipley J. Catovsky D. Houlston R.S. Yuille M.R. Chromosomal imbalances in familial chronic lymphocytic leukaemia: A comparative genomic hybridisation analysis.Leukemia. 2002; 16: 1229-1232Crossref PubMed Scopus (25) Google Scholar, 31Ripolles L. Ortega M. Ortuno F. Gonzalez A. Losada J. Ojanguren J. Soler J.A. Bergua J. Coll M.D. Caballin M.R. Genetic abnormalities and clinical outcome in chronic lymphocytic leukemia.Cancer Genet. Cytogenet. 2006; 171: 57-64Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar We were not previously aware of any additional disease affecting twin 292, but consultation of the medical records confirmed that subject 292 had been diagnosed with CLL prior to sampling of his blood in the course of our study (Table S1). We have thus “rediagnosed” a clone of CLL cells containing two somatic and pathogenic CNVs in this twin. In this case, because we are studying the correct target tissue, we are confident that these two changes are truly pathogenic. The fact that we were able to detect this, in spite of a low percentage of cells containing aberrations, is a good illustration of the power of both genome-wide array platforms. As far as we are aware, the chromosome 4 aberration in subject 292 represents the lowest reported number of cells containing a change that has been detected via an array-based genome-wide platform for CNV screening. There are two main challenges in scoring “somatic CNVs” in monozygotic twins or other types of samples used for analysis of somatic mosaicism for copy-number changes. One concern is usually the small size of these CNVs. The second is that these aberrations will typically occur in only a proportion of cells. Both of these aspects make the analysis more challenging than scoring “germline CNVs” that are expected to be present in 100% of studied cells. The other eight STR MZ pairs also showed additional imbalances on the 32K BAC array, and this was replicated on the Illumina beadchip for two pairs. For instance, Figure 2 displays five small deviating loci, concordant between 32K array and Illumina, in twin pairs 491/492 and 701/702. Several other putative CNV loci were found with the 32K arrays in six additional STR MZ pairs (Figures S1A and S1B). These loci were defined by two dye-swap experiments with at least two overlapping BAC clones deviating by >2 global standard deviations, the same criteria used when scoring the 11 Mb and 85 Mb deletions in twin 292. Tables S2–S4 further summarize the deviating loci, defined as single BACs or neighboring/overlapping BACs in all STR-twins with different cutoffs of statistical significance (difference of ≥2 or ≥3 global SDs). There were 31 loci that deviated in three phenotypically discordant MZ pairs and four loci that deviated in four such pairs (Tables S3 and S4). These can be viewed as candidates for containment of genes involved in the development of PD. For the analysis of the ten phenotypically concordant twin pairs from NTR, the Illumina system was the primary platform used (Table S1). In addition to the concordant SNP genotypes (see above), including several CNVs that were shared by both twins of a pair, a few discordances in A and B allele frequencies were also found, suggesting putative de novo somatic CNV events. Figure 3 shows a clear example of a large CNV, which covers ∼1.6 Mb on chromosome 2 in twin pair D and extends from SNPs rs2304429 to rs1662987, implying a deletion in twin D8. On the basis of the quantification, it too is found to be present in less than 100% of the cells. Two additional methods were applied to validate this finding: high-resolution Melting Curve Analysis and pyrosequencing (Figures 3C and 3D). Both methods confirmed the presence of the deletion and indicated that it was present in approximately 70–80% of blood cells from D8. Circumstantial evidence was obtained for other, posttwinning CNVs, but the statistics of identifying somatically mosaic (i.e., incomplete) CNVs by SNP concordance analysis requires further methodological development beyond the scope of this report.Figure 4Statistical Analysis of Two Dye-Swap Experiments from Twin 291 versus 292Show full caption(A) Dye-swap-averaged log2 ratios of the data points from the long arm of chromosome 11 (11q) between twins 291 and 292. Boundaries of the inferred region of deletion are marked. A nonparametric Wilcoxon rank sum test comparing the values of the 120 data points within the region to the 359 data points outside the region yields a p value less than 2.2 × 10−16. In a series of n points, the number of contiguous regions of any length was n(n-1)/2, because a contiguous region was defined by its boundaries. The number of possible regions in the data shown in (A) was therefore 114,481. Thus, even the Bonferroni-corrected p value was on the order of 10−11. This shows that the region of deletion was not merely the result of capitalizing on chance.(B), (C), and (D) display the autocorrelation function (ACF) computed on the data shown in (A). (B) was computed with all data points from 11q, and (C) and (D) were computed on data points within and outside the deleted region, respectively. The ACFs show that the autocorrelation evident in (B) was due almost entirely to the deletion and was negligible after controlling for it.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) (A) Dye-swap-averaged log2 ratios of the data points from the long arm of chromosome 11 (11q) between twins 291 and 292. Boundaries of the inferred region of deletion are marked. A nonparametric Wilcoxon rank sum test comparing the values of the 120 data points within the region to the 359 data points outside the region yields a p value less than 2.2 × 10−16. In a series of n points, the number of contiguous regions of any length was n(n-1)/2, because a contiguous region was defined by its boundaries. The number of possible regions in the data shown in (A) was therefore 114,481. Thus, even the Bonferroni-corrected p value was on the order of 10−11. This shows that the region of deletion was not merely the result of capitalizing on chance. (B), (C), and (D) display the autocorrelation function (ACF) computed on the data shown in (A). (B) was computed with all data points from 11q, and (C) and (D) were computed on data points within and outside the deleted region, respectively. The ACFs show that the autocorrelation evident in (B) was due almost entirely to the deletion and was negligible after controlling for it. Analysis of CNVs is a generally understudied aspect of human genetic variation, particularly in somatic cells. MZ twins represent an excellent focus for such studies because any genotypic difference between twins derived from the same zygote highlights an irrefutable case of somatic variation. It is likely that the confirmed CNVs shown here represent only the “tip of an iceberg” of all CNVs that are actually present in the studied twins. The notion of somatic variation being far more common than previously assumed agrees well with our other, recent results showing CNVs between normal, fully differentiated tissues within an individual human subject (A.P., C.E.G.B., R.A., T.D.d.S., U.M., J.S., D.v.T., A.P., C.C., E.C.P., J.K., and J.P.D., unpublished data). Our findings influence the understanding of phenotypic and genotypic diversity in MZ twins. First, we wish to stress that although our data seem to suggest a difference, it is not justified to conclude that phenotypically discordant MZ twins are more frequently affected by CNV than are concordant MZ twins. To assess this question, larger cohorts of both twin categories need to be analyzed, preferably by use of DNA extracted from multiple tissues. On the other hand, some of the CNVs in twins discordant for Parkinson disease, parkinsonism, or Lewy body dementia might be pathogenic for these phenotypes, especially when they would also be present in the affected cells of the central nervous system. Indeed, a frequent limitation of CNV analyses as generally performed in the context of somatic disorders is that the genotype of one tissue analyzed (usually blood) might not always be relevant to the genotype of the tissue responsible for the disease, a phenomenon well known for other disorders.32Helderman-van den Enden A.T. Ginjaar H.B. Kneppers A.L. Bakker E. Breuning M.H. de Visser M. Somatic mosaicism of a point mutation in the dystrophin gene in a patient presenting with an asymmetrical muscle weakness and contractures.Neuromuscul. Disord. 2003; 13: 317-321Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6) Google Scholar Second, our findings issue a note of caution. Because genome-wide tools show de novo CNVs in healthy individuals, we should expect such changes when analyzing patients. The detection of de novo aberrations has so far been considered evidence for a causal link between mutation and disease status of a patient. We show that one should be careful when drawing such conclusions. Finally, estimating the frequency with which de novo CNVs occur is currently difficult. On the basis of the detection of one megabase-range, confirmed CNV among ten unselected, phenotypically concordant MZ twin pairs next to several potential ones with a lower degree of cellular mosaicism and/or smaller size, the de novo posttwinning CNV frequency could be as high as 5% on a per-individual basis or 10% per twinning event. The detection rate among the discordant Parkinson twins suggests an even higher figure, but this is within a selected, discordant group and thus might represent a mixture of phenotypically relevant, as well as random, and phenotypically neutral CNV events. This figure is clearly only a first approximation, and a larger cohort of MZ twins needs to be studied in order to more accurately define the frequency. It is not straightforward to derive supporting evidence from other studies, because parents were typically not analyzed in these studies. One such estimate, based on the de novo deletion frequency in the DMD gene [MIM 300377], which lacks conspicuous low-copy repeats (segmental duplications) enhancing propensity for rearrangements, arrives at one de novo deletion per eight newborns and one duplication per 50 newborns.33van Ommen G.J. Frequency of new copy number variation in humans.Nat. Genet. 2005; 37: 333-334Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar Sebat et al.34Sebat J. Lakshmi B. Malhotra D. Troge J. Lese-Martin C. Walsh T. Yamrom B. Yoon S. Krasnitz A. Kendall J. et al.Strong association of de novo copy number mutations with autism.Science. 2007; 316: 445-449Crossref PubMed Scopus (1972) Google Scholar mention the detection of one de novo deletion when 28 CEPH individuals were studied, an essentially similar frequency. We note that the frequency of de novo CNVs strongly depends on the cutoff criteria set to detect these, especially when the size of an aberration and the number of cells affected by it diminish. In the above circumstances, the confirmation of CNVs via alternative techniques becomes particularly challenging. Our work clearly suggests a need for new, better methods for confirmatory analyses, of which massively parallel sequencing seems promising.15Korbel J.O. Urban A.E. Affourtit J.P. Godwin B. Grubert F. Simons J.F. Kim P.M. Palejev D. Carriero N.J. Du L. et al.Paired-End Mapping Reveals Extensive Structural Variation in the Human Genome.Science. 2007; 318: 420-426Crossref PubMed Scopus (848) Google Scholar On the other hand, our results also point to the feasibility of studies targeting larger cohorts of MZ twins discordant for various phenotypes as a way to characterize genetic factors predisposing one to disease. Future studies should ideally be performed with the use of DNA extracted from more than one tissue, or from cells derived from the same developmental lineage as the target tissue that is responsible for generation of the discordant phenotype. This study was supported by funds from the Health Services Foundation and the General Endowment Fund (HSF, GEF) from the University of Alabama at Birmingham Medical School, the Swedish Cancer Society, the Swedish Children's Cancer Foundation, and the U.S. Army Medical Research and Materiel Command (award no. W81XWH-04-1-0269 to J.P.D), as well as by Netherlands Genomics Initiative funds to the Center for Medical Systems Biology supporting A.A.C.H.G., J.T.d.D., D.I.B., and G.J.B.v.O. The twin specimens and phenotypic data were collected with the support of National Institutes of Health (NIH) grant ES10758 to N.L.P. S.E. acknowledges the support of NIH grant 5T32HL072757-04, and D.B.A. acknowledges the support of NIH grants 3P30DK056336-05S2 and 5R01ES009912-08.We thank Drs. Eline Slagboom and Claudia Ruivenkamp for sample contribution, guidance, and discussions, as well as Drs. Bruce A. Korf, Lisa Guay-Woodford, Jay McDonald, and Marco Marra for critical comments on the manuscript. We also thank Dr. Doug Horsman for valuable advice about the genetics of CLL. Download .pdf (.35 MB) Help with pdf files Document S1. Two Figures The URLs for data presented herein are as follows:CHORI BACPAC Resources, http://bacpac.chori.org/genomicRearrays.phpDatabase of Genomic Variants, http://projects.tcag.ca/variation/GEO omnibus main page, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/Human Genome Browser, http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewayLinnaeus Centre for Bioinformatics (LCB) environment for microarray-data management, http://www.lcb.uu.se/lcbdw.phpOnline Mendelian Inheritance in Man, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OmimWilcox.Test Function for R, http://stat.ethz.ch/R-manual/R-patched/library/stats/html/wilcox.test.html The array data were deposited at the GEO main page at NCBI under the accession number GSE9609.

The discovery of drivers of cancer has traditionally focused on protein-coding genes

The genomes of higher organisms are packaged in nucleosomes with functional histone modifications. Until now, genome-wide nucleosome and histone modification studies have focused on transcription start sites (TSSs) where nucleosomes in RNA polymerase II (RNAPII) occupied genes are well positioned and have histone modifications that are characteristic of expression status. Using public data, we here show that there is a higher nucleosome-positioning signal in internal human exons and that this positioning is independent of expression. We observed a similarly strong nucleosome-positioning signal in internal exons of Caenorhabditis elegans . Among the 38 histone modifications analyzed in man, H3K36me3, H3K79me1, H2BK5me1, H3K27me1, H3K27me2, and H3K27me3 had evidently higher signals in internal exons than in the following introns and were clearly related to exon expression. These observations are suggestive of roles in splicing. Thus, exons are not only characterized by their coding capacity, but also by their nucleosome organization, which seems evolutionarily conserved since it is present in both primates and nematodes.

Abstract Motivation For machine learning to matter beyond intellectual curiosity, the models developed therefrom must be adopted within the greater scientific community. In this study, we developed an interpretable machine learning framework that allows identification of semantics from various datatypes. Our package can analyze and illuminate co-predictive mechanisms reflecting biological processes. Results We present R.ROSETTA, an R package for building and analyzing interpretable machine learning models. R.ROSETTA gathers combinatorial statistics via rule-based modelling for accessible and transparent results, well-suited for adoption within the greater scientific community. The package also provides statistics and visualization tools that facilitate minimization of analysis bias and noise. Investigating case-control studies of autism, we showed that our tool provided hypotheses for potential interdependencies among features that discerned phenotype classes. These interdependencies regarded neurodevelopmental and autism-related genes. Although our sample application of R.ROSETTA was used for transcriptomic data analysis, R.ROSETTA works perfectly with any decision-related omics data. Availability The R.ROSETTA package is freely available at https://github.com/komorowskilab/R.ROSETTA . Contact mateusz.garbulowski@icm.uu.se (Mateusz Garbulowski), jan.komorowski@icm.uu.se (Jan Komorowski)

Abstract Motivation Small-compound databases contain large amount of information for metabolites and metabolic pathways. However, the plethora of such databases and the redundancy of their information lead to major issues with analysis and standardization. Lack of preventive establishment of means of data access at the infant stages of a project might lead to mislabelled compounds, reduced statistical power and large delays in delivery of results. Results We developed MetaFetcheR, an open-source R package that links metabolite data from several small-compound databases, resolves inconsistencies and covers a variety of use-cases of data fetching. We showed that the performance of MetaFetcheR was superior to existing approaches and databases by benchmarking the performance of the algorithm in two independent case studies based on two published datasets. Availability MetaFetcheR is available at https://github.com/komorowskilab/MetaFetcheR/ .

Abstract Simian immunodeficiency virus (SIV) challenge of rhesus macaques (RMs) vaccinated with Rhesus Cytomegalovirus (RhCMV) vectors expressing SIV proteins (RhCMV/SIV) results in a binary outcome: stringent control and subsequent clearance of highly pathogenic SIV in ~55% of vaccinated RMs with no protection in the remaining 45%. Although previous work suggests that unconventionally restricted, SIV-specific, effector-memory (EM)-biased CD8 + T cell responses are necessary for efficacy, the magnitude of these responses does not predict efficacy, and the basis of protection vs. non-protection in RhCMV/SIV vector-vaccinated RMs has not been elucidated. Here, we report that RhCMV/SIV vector administration strikingly alters the whole blood transcriptome of vaccinated RMs, with the sustained induction of specific immune-related pathways, including non-canonical T cell receptor (TCR), toll-lie receptor (TLR), inflammasome/cell death, and interleukin-15 (IL-15) signaling, significantly predicting protection. The IL-15 gene expression signature was further evaluated in an independent RM IL-15 treatment cohort, revealing that in whole blood the response to IL-15 is inclusive of innate and adaptive immune gene expression networks that link with RhCMV/SIV vaccine efficacy. We also show that this IL-15 response signature similarly tracks with vaccine protection in an independent RhCMV/SIV vaccination/SIV challenge RM validation cohort. Thus, the RhCMV/SIV vaccine imparts a coordinated and persistent induction of innate and adaptive immune pathways featuring IL-15, a known regulator of CD8 + T cell function, that enable vaccine-elicited CD8 + T cells to mediate protection against highly pathogenic SIV challenge. Author Summary SIV insert-expressing vaccine vectors based on strain 68-1 RhCMV elicit robust, highly effector-memory-biased T cell responses that are associated with an unprecedented level of SIV control after challenge (replication arrest leading to clearance) in slightly over half of vaccinated monkeys. Since efficacy is not predicted by standard measures of immunogenicity, we used functional genomics analysis of RhCMV/SIV vaccinated monkeys with known challenge outcomes to identify immune correlates of protection. We found that arrest of viral replication after challenge significantly correlates with a vaccine-induced response to IL-15 that includes modulation of T cell, inflammation, TLR signaling, and cell death programming. These data suggest that RhCMV/SIV efficacy is not based on chance, but rather, results from a coordinated and sustained vaccine-mediated induction of innate and adaptive immune pathways featuring IL-15, a known regulator of CD8 + effector-memory T cell function, that enable vaccine-elicited CD8 + T cells to mediate efficacy.

Abstract Defects in pancreatic islets and the progression of multi-tissue insulin resistance in combination with environmental factors are the main causes of type 2 diabetes (T2D). Mass spectrometry-based proteomics of five key-metabolic tissues on a cohort of 42 multi-organ donors provided deep coverage of the proteomes of pancreatic islets, visceral adipose tissue (VAT), liver, skeletal muscle and serum. Enrichment analysis of gene ontology (GO) terms built a tissue-specific map of the chronological order of altered biological processes across healthy controls (CTRL), pre-diabetes (PD) and T2D subjects. This unique dataset allowed us to explore alterations of entire biological pathways and individual proteins in multiple tissues. We confirmed the significant decrease of the citric acid cycle and the respiratory electron transport in VAT and muscle of T2D and we provided a thorough visual representation of the complete set of downregulated proteins. Importantly, we found widespread novel alterations in relevant biological pathways including the increase in hemostasis in pancreatic islets of PD, the increase in the complement cascade in liver and pancreatic islets of PD and the elevation in cholesterol biosynthesis in liver of T2D. Overall, our findings suggest inflammatory, immune and vascular impairments in pancreatic islets as potentially causal factors of insufficient insulin production and increased glucagon levels in the early stages of T2D. In contrast alterations in lipid metabolism and mitochondrial function in the liver and VAT/muscle, respectively, became evident later in manifest T2D. This first multi-tissue proteomic map indicates the temporal order of tissue-specific metabolic dysregulation in T2D development.

ABSTRACT Transcriptomic analyses are commonly used to identify differentially expressed genes between patients and controls, or within individuals across disease courses. These methods, whilst effective, cannot encompass the combinatorial effects of genes driving disease. We applied rule-based machine learning (RBML) models and rule networks (RN) to an existing paediatric Systemic Lupus Erythematosus (SLE) blood expression dataset, with the goal of developing gene networks to separate low and high disease activity (DA1 and DA3). The resultant model had an 81% accuracy to distinguish between DA1 and DA3, with unsupervised hierarchical clustering revealing additional subgroups indicative of the immune axis involved or state of disease flare. These subgroups correlated with clinical variables, suggesting that the gene sets identified may further the understanding of gene networks that act in concert to drive disease progression. This included roles for genes i) induced by interferons ( IFI35 and OTOF ), ii) key to SLE cell types ( KLRB1 encoding CD161), or iii) with roles in autophagy and NF-κB pathway responses ( CKAP4 ). As demonstrated here, RBML approaches have the potential to reveal novel gene patterns from within a heterogeneous disease, facilitating patient clinical and therapeutic stratification.