The protocol described here efficiently directs human pluripotent stem cells (hPSCs) to functional cardiomyocytes in a completely defined, growth factor– and serum-free system by temporal modulation of regulators of canonical Wnt signaling. Appropriate temporal application of a glycogen synthase kinase 3 (GSK3) inhibitor combined with the expression of β-catenin shRNA or a chemical Wnt inhibitor is sufficient to produce a high yield (0.8–1.3 million cardiomyocytes per cm2) of virtually pure (80–98%) functional cardiomyocytes in 14 d from multiple hPSC lines without cell sorting or selection. Qualitative (immunostaining) and quantitative (flow cytometry) characterization of differentiated cells is described to assess the expression of cardiac transcription factors and myofilament proteins. Flow cytometry of BrdU incorporation or Ki67 expression in conjunction with cardiac sarcomere myosin protein expression can be used to determine the proliferative capacity of hPSC-derived cardiomyocytes. Functional human cardiomyocytes differentiated via these protocols may constitute a potential cell source for heart disease modeling, drug screening and cell-based therapeutic applications.

Summary

 Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived endothelial cells and their progenitors may provide the means for vascularization of tissue-engineered constructs and can serve as models to study vascular development and disease. Here, we report a method to efficiently produce endothelial cells from hPSCs via GSK3 inhibition and culture in defined media to direct hPSC differentiation to CD34⁺CD31⁺ endothelial progenitors. Exogenous vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment was dispensable, and endothelial progenitor differentiation was β-catenin dependent. Furthermore, by clonal analysis, we showed that CD34⁺CD31⁺CD117⁺TIE-2⁺ endothelial progenitors were multipotent, capable of differentiating into calponin-expressing smooth muscle cells and CD31⁺CD144⁺vWF⁺I-CAM1⁺ endothelial cells. These endothelial cells were capable of 20 population doublings, formed tube-like structures, imported acetylated low-density lipoprotein, and maintained a dynamic barrier function. This study provides a rapid and efficient method for production of hPSC-derived endothelial progenitors and endothelial cells and identifies WNT/β-catenin signaling as a primary regulator for generating vascular cells from hPSCs.

SUMMARY Neutrophils, the most abundant white blood cells in the circulation, are closely related to cancer development and progression. Primary neutrophils from healthy donors present potent cytotoxicity against different human cancer cell lines through direct contact and via the generation of reactive oxygen species (ROS). However, due to their short half-life and resistance to genetic modification, neutrophils have not yet been engineered with widely used chimeric antigen receptors (CARs) to enhance their anti-tumor cytotoxicity for targeted immunotherapy. Here, we genetically engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with different synthetic CARs and successfully differentiated them into functional neutrophils by implementing a novel chemically-defined differentiation platform. Neutrophils expressing the chlorotoxin (CLTX)-T-CAR presented specific cytotoxicity against glioblastoma (GBM) cells both in monolayer and 3D cultures. In a GBM xenograft mouse model, systematically-administered CLTX-T-CAR neutrophils also displayed enhanced anti-tumor activity and prolonged animal survival compared with peripheral blood-neutrophils, hPSC-neutrophils and CLTX-NK-CAR natural killer (NK) cells. Collectively, we established a new platform for production of CAR-neutrophils, paving the way to myeloid cell-based therapeutic strategies that would complement and boost current cancer treatment approaches.

A new protocol can customize the flavor of lab-grown meat by controlling the level of fat deposited between muscle cells.

Abstract Transcription factors (TFs) play critical roles in stem cell maintenance and differentiation. Using single cell RNA sequencing, we investigated TFs expressed in hemogenic endothelial (HE) progenitors differentiated from human pluripotent stem cells (hPSCs) and identified upregulated expression of SOXF factors SOX7, SOX17 , and SOX18 in the HE population. To test whether overexpression of these factors increases HE differentiation efficiency, we established inducible hPSC lines and found only SOX17 improved differentiation. Temporal expression analysis further revealed SOX17 was turned on immediately before VE-Cadherin, indicating SOX17 may be a causative factor for HE differentiation. Upon SOX17 knockdown via CRISPR-Cas13d, HE differentiation was significantly abrogated. Strikingly, we discovered SOX17 overexpression alone is sufficient to generate more than 50% CD34 + VE-cadherin + CD73 - cells that could be directed to hematopoietic progenitors, which emerged via an endothelial-to-hematopoietic transition and significantly upregulated definitive hematopoietic transcriptional programs. Functional assays showed that these progenitors can differentiate into blood cells from multiple lineages. Our analyses reveal an uncharacterized function of SOX17 in directing hPSCs differentiation towards HE cells. Significance Statement Hemogenic endothelial (HE) cells have been generated from human pluripotent stem cells (hPSCs) to study blood development. However, their full transcriptomic characterization and key genes involving in directing HE differentiation is unclear. Utilizing single cell RNA-seq analysis, we find that SOX17 is solely expressed in HE cells and is also required for HE differentiation. Strikingly, we find that overexpression of SOX17 alone is sufficient to program hPSCs into CD34+VE-cadherin+CD73-HE cells, which could further differentiate into blood progenitors. Our research reveals that SOX17 is sufficient to direct hPSCs differentiation to HE cells. Classification Physical Sciences/Engineering; Biological Sciences/Cell Biology.

The processes of cell proliferation, differentiation, migration, and self-organization during early embryonic development are governed by dynamic, spatially and temporally varying morphogen signals. Analogous tissue patterns emerge spontaneously in embryonic stem cell (ESC) models for gastrulation, but mechanistic insight into this self-organization is limited by a lack of molecular methods to precisely control morphogen signal dynamics. Here we combine optogenetic stimulation and single-cell imaging approaches to study self-organization of human pluripotent stem cells. Precise control of morphogen signal dynamics, achieved through activation of canonical Wnt/β-catenin signaling over a broad high dynamic range (>500-fold) using an optoWnt optogenetic system, drove broad transcriptional changes and mesendoderm differentiation of human ESCs at high efficiency (>95% cells). Furthermore, activating Wnt signaling in subpopulations of ESCs in 2D and 3D cultures induced cell self-organization and morphogenesis reminiscent of human gastrulation, including changes in cell migration and epithelial to mesenchymal transition. Our findings thus reveal an instructive role for Wnt in directing cell patterning in this ESC model for gastrulation.

Precise insertion of a fluorescent protein into a lineage-specific gene in human pluripotent stem cells (hPSCs) presents challenges due to the low knockin efficiency and difficulties in selecting the correctly targeted cells. Here we introduce the ModRNA-based Activation for Gene Insertion and Knockin (MAGIK) approach to enhance knockin efficacy in hPSCs. MAGIK operates in two steps: first, it employs a Cas9-2A-p53DD modRNA with a mini-donor plasmid (without a drug-selection cassette) to significantly enhance efficiency; second, a dCas9 activator modRNA and a dgRNA are used to temporarily activate the successfully targeted gene, allowing for live cell sorting without single cell cloning. Consequently, MAGIK eliminates the need for drug selection cassettes or labor-intensive single cell colony screening, expediting precise genetic integration. We have demonstrated that MAGIK can be utilized to insert fluorescent proteins into various genes, including SOX17, NKX6.1, NKX2.5 and PDX1, across multiple hPSC lines, showcasing its robustness. This innovative MAGIK approach streamlines the process and provides a promising solution for targeted genetic modifications in hPSCs.

Spatially and temporally varying patterns of morphogen signals during development drive cell fate specification at the proper location and time. However, current in vitro methods typically do not allow for precise, dynamic, spatiotemporal control of morphogen signaling and are thus insufficient to readily study how morphogen dynamics impact cell behavior. Here we show that optogenetic Wnt/β-catenin pathway activation can be controlled at user-defined intensities, temporal sequences, and spatial patterns using novel engineered illumination devices for optogenetic photostimulation and light activation at variable amplitudes (LAVA). The optical design of LAVA devices was optimized for uniform illumination of multi-well cell culture plates to enable high-throughput, spatiotemporal optogenetic activation of signaling pathways and protein-protein interactions. Using the LAVA devices, variation in light intensity induced a dose-dependent response in optoWnt activation and downstream Brachyury expression in human embryonic stem cells (hESCs). Furthermore, time-varying and spatially localized patterns of light revealed tissue patterning that models embryonic presentation of Wnt signals in vitro. The engineered LAVA devices thus provide a low-cost, user-friendly method for high-throughput and spatiotemporal optogenetic control of cell signaling for applications in developmental and cell biology.

Summary CRISPR systems have revolutionized biomedical research because they offer an unprecedented opportunity to explore the application of genome editing in human pluripotent stem cells (hPSCs). Due to the inherent simplicity of CRISPR systems, requiring a Cas protein and its corresponding single guide RNA (sgRNA), they are more widely adopted and used for diverse biomedical research than their predecessors (zinc finger nucleases and TALENs). However, a bottleneck of applying CRISPR systems in hPSCs is how to deliver CRISPR effectors easily and efficiently into hPSCs. Herein, we developed modified mRNA (modRNA) based CRIPSR systems that utilized Cas9 or base editor (ABE8e) modRNA for genome editing of hPSCs via simple lipid-based transfection. We have achieved 71.09% ± 9.13% and 68.53% ± 3.81% gene knockout (KO) efficiency with Cas9 modRNA and ABE8e modRNA, respectively, which is significantly higher than plasmid-based systems. In summary, we demonstrate that our non-integrating modRNA based CRISPR methods hold great promise as the more efficient and accessible techniques for genome editing of hPSCs.