Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) catalyze the oxidative cleavage of polysaccharides. Identification of a hydrogen peroxide–dependent pathway for sugar oxidation by these enzymes challenges the prevailing model that LPMOs are oxygen-dependent monooxygenases. Enzymes currently known as lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) play an important role in the conversion of recalcitrant polysaccharides, but their mode of action has remained largely enigmatic. It is generally believed that catalysis by LPMOs requires molecular oxygen and a reductant that delivers two electrons per catalytic cycle. Using enzyme assays, mass spectrometry and experiments with labeled oxygen atoms, we show here that H2O2, rather than O2, is the preferred co-substrate of LPMOs. By controlling H2O2 supply, stable reaction kinetics are achieved, the LPMOs work in the absence of O2, and the reductant is consumed in priming rather than in stoichiometric amounts. The use of H2O2 by a monocopper enzyme that is otherwise cofactor-free offers new perspectives regarding the mode of action of copper enzymes. Furthermore, these findings have implications for the enzymatic conversion of biomass in Nature and in industrial biorefining.

ABSTRACT Copper Radical Alcohol Oxidases (CRO-AlcOx), which have been recently discovered among fungal phytopathogens are attractive for the production of fragrant fatty aldehydes. To investigate the secretion of CRO-AlcOx by natural fungal strains, we undertook time-course analyses of the secretomes of three Colletotrichum species ( C. graminicola, C. tabacum and C. destructivum ) using proteomics. The addition of a copper-manganese-ethanol mixture to Colletotrichum cultures unexpectedly induced the secretion of up to 400 proteins, 29-52% of which were carbohydrate-active enzymes (CAZymes), including a wide diversity of copper-containing oxidoreductases from the auxiliary activities (AA) class (AA1, AA3, AA5, AA7, AA9, AA11-AA13, AA16). Under these specific conditions, while a CRO-glyoxal oxidase from the AA5_1 subfamily was among the most abundantly secreted proteins, the targeted AA5_2 CRO-AlcOx were secreted at lower levels, suggesting heterologous expression as a more promising strategy for CRO-AlcOx production and utilization. C. tabacum and C. destructivum CRO-AlcOx were expressed in Pichia pastoris and their preference toward both aromatic and aliphatic primary alcohols was assessed. The CRO-AlcOx from C. destructivum was further investigated in applied settings, revealing a full conversion of C6 and C8 alcohols into their corresponding fragrant aldehydes. IMPORTANCE In the context of the industrial shift toward greener processes, the biocatalytic production of aldehydes is of utmost interest owing to their importance as intermediates in preparative chemistry and for their use as flavors and fragrances ingredients. In the search for new biocatalysts, CRO-AlcOx have the potential to become platform enzymes for the oxidation of alcohols to aldehydes. The use of crude fungal secretomes is often seen has an appealing approach by industries since alleviating various costs pertaining to biocatalysts production. However, the secretion of CRO-AlcOx by natural fungal strains has never been explored. This study showed that Colletotrichum species can secrete a broad diversity of copper-containing enzymes, but only little amount of CRO-AlcOx. Thus, recombinant expression remains the most promising approach. The potential of CRO-AlcOx as biocatalyst for flavor and fragrance applications was confirmed through the production of two new enzymes with activity on fatty alcohols.

The discovery of Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) has been instrumental for the development of economically sustainable lignocellulose biorefineries. Despite the obvious importance of these exceptionally powerful redox enzymes, their mode of action remains enigmatic and their activity and stability under process conditions are hard to control. By using enzyme assays, mass spectrometry and experiments with labeled oxygen atoms, we show that H2O2, and not O2 as previously thought, is the co-substrate of LPMOs. By controlling H2O2 supply, stable reaction kinetics and high enzymatic rates are achieved, the LPMOs work under anaerobic conditions, and the need for adding stoichiometric amounts of reductants is alleviated. These results offer completely new perspectives regarding the mode of action of these unique mono-copper enzymes, the enzymatic conversion of biomass in Nature, and industrial biorefining.

Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) are a recently discovered class of monocopper enzymes, broadly distributed across the Tree of Life. We recently reported that LPMOs can use H2O2 as an oxidant, revealing a novel reaction pathway. Here, we aimed to elucidate the H2O2-mediated reaction mechanism with experimental and computational approaches. In silico studies suggest that a network of hydrogen bonds, involving both the enzyme and the substrate, brings H2O2 into a strained reactive conformation, and guides the derived hydroxyl radical towards formation of a copper-oxyl intermediate. The initial H2O2 homolytic cleavage and subsequent hydrogen atom abstraction from chitin by the copper-oxyl intermediate are suggested to be the main energy barriers. Under single turnover conditions, stopped-flow fluorimetry demonstrates that LPMO-Cu(II) reduction to Cu(I) is a fast process compared to the re-oxidation reactions. We found that re-oxidation of LPMO-Cu(I) is 2000-fold faster with H2O2 than with O2, the latter being several orders of magnitude slower than rates reported for other monooxygenases. In agreement with the notion of ternary complex formation, when chitin is added, re-oxidation by H2O2 is accelerated whereas that by O2 slows. Simulations indicated that Glu60, a highly-conserved residue, gates the access to the confined active site and constrains H2O2 during catalysis, and Glu60 mutations significantly decreased the enzyme performance. By providing molecular and kinetic insights into the peroxygenase activity of chitinolytic LPMOs, this study will aid the development of applications of enzymatic and synthetic copper catalysis and contribute to understanding pathogenesis, notably chitinolytic plant defenses against fungi and insects.

Abstract Filamentous fungi are keystone microorganisms in the regulation of many processes occurring on Earth, such as plant biomass decay, pathogenesis as well as symbiotic associations. In many of these processes, fungi secrete carbohydrate-active enzymes (CAZymes) to modify and/or degrade carbohydrates. Ten years ago, while evaluating the potential of a secretome from the maize pathogen Ustilago maydis to supplement lignocellulolytic cocktails, we noticed it contained many unknown or poorly characterized CAZymes. Here, and after re-annotation of this dataset and detailed phylogenetic analyses, we observed that several CAZymes (including glycoside hydrolases and carbohydrate oxidases) are predicted to act on the fungal cell wall (FCW), notably on β-1,3-glucans. We heterologously produced and biochemically characterized two new CAZymes, called Um GH16_1-A and Um AA3_2-A. We show that Um GH16_1-A displays β-1,3-glucanase activity, with a preference for β-1,3-glucans with short β-1,6 substitutions, and Um AA3_2-A is a dehydrogenase catalyzing the oxidation of β-1,3- and β-1,6-gluco-oligosaccharides into the corresponding aldonic acids. Working on model β-1,3-glucans, we show that the linear oligosaccharide products released by Um GH16_1-A are further oxidized by Um AA3_2-A, bringing to light a putative biocatalytic cascade. Interestingly, analysis of available transcriptomics data indicates that both Um GH16_1-A and Um AA3_2-A are co-expressed, only during early stages of U. maydis infection cycle. Altogether, our results suggest that both enzymes are connected and that additional accessory activities still need to be uncovered to fully understand the biocatalytic cascade at play and its physiological role. Importance Filamentous fungi play a central regulatory role on Earth, notably in the global carbon cycle. Regardless of their lifestyle, filamentous fungi need to remodel their own cell wall (mostly composed of polysaccharides) to grow and proliferate. To do so, they must secrete a large arsenal of enzymes, most notably carbohydrate-active enzymes (CAZymes). However, research on fungal CAZymes over past decades has mainly focused on finding efficient plant biomass conversion processes while CAZymes directed at the fungus itself have remained little explored. In the present study, using the maize pathogen Ustilago maydis as model, we set off to evaluate the prevalence of CAZymes directed towards the fungal cell wall during growth of the fungus on plant biomass and characterized two new CAZymes active on fungal cell wall components. Our results suggest the existence of a biocatalytic cascade that remains to be fully understood.

ABSTRACT The fish pathogen Aliivibrio (Vibrio) salmonicida LFI1238 is thought to be incapable of utilizing chitin as a nutrient source since approximately half of the genes representing the chitinolytic pathway are disrupted by insertion sequences. In the present study, we combined a broad set of analytical methods to investigate this hypothesis. Cultivation studies revealed that Al. salmonicida grew efficiently on N -acetylglucosamine (GlcNAc) and chitobiose ((GlcNAc) 2 ), the primary soluble products resulting from enzymatic chitin hydrolysis. The bacterium was also able to grow on chitin particles, albeit at a lower rate compared to the soluble substrates. The genome of the bacterium contains five disrupted chitinase genes (pseudogenes) and three intact genes encoding a glycoside hydrolase family 18 (GH18) chitinase and two auxiliary activity family 10 (AA10) lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs). Biochemical characterization showed that the chitinase and LPMOs were able to depolymerize both α- and β-chitin to (GlcNAc) 2 and oxidized chitooligosaccharides, respectively. Notably, the chitinase displayed up to 50-fold lower activity compared to other well-studied chitinases. Deletion of the genes encoding the intact chitinolytic enzymes showed that the chitinase was important for growth on β-chitin, whereas the LPMO gene-deletion variants only showed minor growth defects on this substrate. Finally, proteomic analysis of Al. salmonicida LFI1238 growth on β-chitin showed expression of all three chitinolytic enzymes, and intriguingly also three of the disrupted chitinases. In conclusion, our results show that Al. salmonicida LFI1238 can utilize chitin as a nutrient source and that the GH18 chitinase and the two LPMOs are needed for this ability. IMPORTANCE The ability to utilize chitin as a source of nutrients is important for the survival and spread of marine microbial pathogens in the environment. One such pathogen is Aliivibrio (Vibrio) salmonicida , the causative agent of cold water vibriosis. Due to extensive gene decay, many key enzymes in the chitinolytic pathway have been disrupted, putatively rendering this bacterium incapable of chitin degradation and utilization. In the present study we demonstrate that Al. salmonicida can degrade and metabolize chitin, the most abundant biopolymer in the ocean. Our findings shed new light on the environmental adaption of this fish pathogen.