Comparative analysis of RNA sequences is the basis for the detailed and accurate predictions of RNA structure and the determination of phylogenetic relationships for organisms that span the entire phylogenetic tree. Underlying these accomplishments are very large, well-organized, and processed collections of RNA sequences. This data, starting with the sequences organized into a database management system and aligned to reveal their higher-order structure, and patterns of conservation and variation for organisms that span the phylogenetic tree, has been collected and analyzed. This type of information can be fundamental for and have an influence on the study of phylogenetic relationships, RNA structure, and the melding of these two fields. We have prepared a large web site that disseminates our comparative sequence and structure models and data. The four major types of comparative information and systems available for the three ribosomal RNAs (5S, 16S, and 23S rRNA), transfer RNA (tRNA), and two of the catalytic intron RNAs (group I and group II) are: (1) Current Comparative Structure Models; (2) Nucleotide Frequency and Conservation Information; (3) Sequence and Structure Data; and (4) Data Access Systems. This online RNA sequence and structure information, the result of extensive analysis, interpretation, data collection, and computer program and web development, is accessible at our Comparative RNA Web (CRW) Site http://www.rna.icmb.utexas.edu . In the future, more data and information will be added to these existing categories, new categories will be developed, and additional RNAs will be studied and presented at the CRW Site.

Abstract Amplicon sequencing has revolutionized our ability to study DNA collected from environmental samples by providing a rapid and sensitive technique for microbial community analysis that eliminates the challenges associated with lab cultivation and taxonomic identification through microscopy. In water resources management, it can be especially useful to evaluate ecosystem shifts in response to natural and anthropogenic landscape disturbances to signal potential water quality concerns, such as the detection of toxic cyanobacteria or pathogenic bacteria. Amplicon sequencing data consist of discrete counts of sequence reads, the sum of which is the library size. Groups of samples typically have different library sizes that are not representative of biological variation; library size normalization is required to meaningfully compare diversity between them. Rarefaction is a widely used normalization technique that involves the random subsampling of sequences from the initial sample library to a selected normalized library size. Rarefying is often dismissed as statistically invalid because subsampling effectively discards a portion of the observed sequences. Nonetheless, it remains prevalent in practice. Notably, the superiority of rarefying relative to many other normalization approaches has been argued in diversity analysis. Here, repeated rarefying is proposed as a tool for diversity analyses to normalize library sizes. This enables (i) proportionate representation of all observed sequences and (ii) characterization of the random variation introduced to diversity analyses by rarefying to a smaller library size shared by all samples. While many deterministic data transformations are not tailored to produce equal library sizes, repeatedly rarefying reflects the probabilistic process by which amplicon sequencing data are obtained as a representation of the source microbial community. Specifically, it evaluates which data might have been obtained if a particular sample’s library size had been smaller and allows graphical representation of the effects of this library size normalization process upon diversity analysis results.

Abstract Diversity analysis of amplicon sequencing data is mainly limited to plug-in estimates calculated using normalized data to obtain a single value of an alpha diversity metric or a single point on a beta diversity ordination plot for each sample. As recognized for count data generated using classical microbiological methods, read counts obtained from a sample are random data linked to source properties by a probabilistic process. Thus, diversity analysis has focused on diversity of (normalized) samples rather than probabilistic inference about source diversity. This study applies fundamentals of statistical analysis for quantitative microbiology (e.g., microscopy, plating, most probable number methods) to sample collection and processing procedures of amplicon sequencing methods to facilitate inference reflecting the probabilistic nature of such data and evaluation of uncertainty in diversity metrics. Types of random error are described and clustering of microorganisms in the source, differential analytical recovery during sample processing, and amplification are found to invalidate a multinomial relative abundance model. The zeros often abounding in amplicon sequencing data and their implications are addressed, and Bayesian analysis is applied to estimate the source Shannon index given unnormalized data (both simulated and real). Inference about source diversity is found to require knowledge of the exact number of unique variants in the source, which is practically unknowable due to library size limitations and the inability to differentiate zeros corresponding to variants that are actually absent in the source from zeros corresponding to variants that were merely not detected. Given these problems with estimation of diversity in the source even when the basic multinomial model is valid, sample-level diversity analysis approaches are discussed. Highlights Random error in amplicon sequencing method should be considered in diversity analysis Clustering, amplification, and differential recovery distort sample diversity The multinomial model for compositional count data is compromised by amplification There are three types of zeros in amplicon sequencing data, including missing zeros Source alpha diversity estimates are biased by unknown number of unique variants

Abstract Cyanobacteria threaten public and ecosystem health globally through the production of secondary metabolites including potent toxins, and disruption of water treatment processes. Warmer water temperatures and high nutrient availability are key characteristics associated with the occurrence of cyanobacteria. There is typically concern of cyanobacteria blooms (e.g., visible biomass accumulations) occurring in the summer season of eutrophic systems. However, in this study, the proliferation of cyanobacteria in lakes across all seasons and in absence of visual biomass indicators of bloom condition was observed in three oligotrophic lakes of the Turkey Lakes Watershed (TLW) in Ontario, located within a sugar maple dominated forest on the Canadian Shield. Almost 40 years of ice phenology data showed that rising temperatures have led to significantly longer ice-free periods and aquatic growing seasons in TLW. Warming is especially evident in the autumn, with the onset of ice-on periods commencing significantly later in the year. Cyanobacterial communities in three interconnected temperate, oligotrophic lakes were characterized over an 18-month period from July 2018 to January 2020 (across 10 synoptic sampling events) using amplicon sequencing of the V4 region of the 16S rRNA gene. During the winter, there was low abundance or occasional absence of cyanobacteria; however, a non-photosynthetic basal lineage of cyanobacteria (Melainabacteria) was present during periods of ice cover. Notably, photosynthetic populations reappeared in the water column immediately following the loss of ice-cover—they were especially abundant in lakes with surficial geology and lake morphometry that favor greater availability of fine sediment and associated nutrients. Thus, this collective analysis demonstrates that the convergence of key abiotic and biotic factors—climate forcing of hydrological and biogeochemical processes, and intrinsic landscape features—enable increases in the relative abundance of potentially toxic cyanobacteria within the temperate forest biome of Canada over increasingly longer periods of time.

Skin is the largest organ of the body and represents the primary physical barrier between mammals and their external environment. The objective of this research was to generate a skin microbiota baseline for members of the class Mammalia, testing the effects of host species, geographic location, body region, and biological sex. The back, torso, and inner thigh regions of 177 non-human mammals were collected to include representatives from 38 species and 10 mammalian orders. Animals were collected from local farms, zoos, households, and the wild. All samples were amplified using the V3-V4 16S rRNA gene region and sequenced using a MiSeq (Illumina). For reference, previously published skin microbiome data from 20 human participants, sampled using an identical protocol to the non-human mammals, were included in the analysis. Human skin was significantly less diverse than all other mammalian orders and the factor most strongly associated with community variation for all samples was whether the host was a human. Within non-human samples, host taxonomic order was the most significant factor influencing the skin community, followed by the geographic location of the habitat. By comparing the congruence between known host phylogeny and microbial community dendrograms, we observed that Artiodactyla (even-toed ungulates) and Perissodactyla (odd-toed ungulates) had significant congruence, providing first evidence of phylosymbiosis between skin communities and their hosts.

Abstract Continental-scale increases in aquatic system eutrophication are linked with increased cyanobacteria threats to recreational water use and drinking water resources globally. Increasing evidence suggests that diurnal vertical migration of cyanobacteria are key factors that must be considered in cyanobacterial bloom risk management. While this has been discussed in marine and eutrophic freshwater contexts, reports of diurnal vertical migration of cyanobacteria in oligotrophic freshwater lakes are scant. Typical monitoring protocols do not reflect these dynamics and frequently focus only on surface water sampling approaches, and either ignore sampling time or recommend large midday timeframes (e.g., 10AM-3PM), thereby preventing accurate characterization of cyanobacterial community dynamics. To evaluate the impact of diurnal migrations and water column stratification on cyanobacterial abundance and composition, communities were characterized in a shallow well-mixed lake interconnected to a thermally stratified lake in the Turkey Lakes Watershed (Ontario, Canada) using amplicon sequencing of the 16S rRNA gene across a multi-time point sampling series in 2018 and 2022. This work showed that cyanobacteria are present in oligotrophic lakes and their community structure varies (i) diurnally, (ii) across the depth of the water column, (iii) interannually within the same lake and (iv) between different lakes that are closely interconnected within the same watershed. It underscored the need for integrating multi-timepoint, multi-depth discrete sampling guidance into lake and reservoir monitoring programs to describe cyanobacteria community dynamics and signal change to inform risk management associated with the potential for cyanotoxin production. Ignoring variability in cyanobacterial community dynamics (such as that reported herein) and reducing sample numbers can lead to a false sense of security and missed opportunities to identify and mitigate changes in trophic status and associated risks such as toxin or taste and odor production, especially in sensitive, oligotrophic systems. Graphical Abstract Highlights ■ Cyanobacterial populations fluctuate sporadically across diurnal cycles ■ Cyanobacterial communities can vary significantly between interconnected lakes ■ Significant annual shifts in communities signal higher risk and need for monitoring ■ Cyanobacteria monitoring for risk management should incorporate time and depth