Positive-strand RNA viruses, a large group including human pathogens such as SARS-coronavirus (SARS-CoV), replicate in the cytoplasm of infected host cells. Their replication complexes are commonly associated with modified host cell membranes. Membrane structures supporting viral RNA synthesis range from distinct spherular membrane invaginations to more elaborate webs of packed membranes and vesicles. Generally, their ultrastructure, morphogenesis, and exact role in viral replication remain to be defined. Poorly characterized double-membrane vesicles (DMVs) were previously implicated in SARS-CoV RNA synthesis. We have now applied electron tomography of cryofixed infected cells for the three-dimensional imaging of coronavirus-induced membrane alterations at high resolution. Our analysis defines a unique reticulovesicular network of modified endoplasmic reticulum that integrates convoluted membranes, numerous interconnected DMVs (diameter 200–300 nm), and "vesicle packets" apparently arising from DMV merger. The convoluted membranes were most abundantly immunolabeled for viral replicase subunits. However, double-stranded RNA, presumably revealing the site of viral RNA synthesis, mainly localized to the DMV interior. Since we could not discern a connection between DMV interior and cytosol, our analysis raises several questions about the mechanism of DMV formation and the actual site of SARS-CoV RNA synthesis. Our data document the extensive virus-induced reorganization of host cell membranes into a network that is used to organize viral replication and possibly hide replicating RNA from antiviral defense mechanisms. Together with biochemical studies of the viral enzyme complex, our ultrastructural description of this "replication network" will aid to further dissect the early stages of the coronavirus life cycle and its virus-host interactions.

The sudden emergence of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) at the end of 2019 from the Chinese province of Hubei and its subsequent pandemic spread highlight the importance of understanding the full molecular details of coronavirus infection and pathogenesis. Here, we compared a variety of replication features of SARS-CoV-2 and SARS-CoV and analysed the cytopathology caused by the two closely related viruses in the commonly used Vero E6 cell line. Compared to SARS-CoV, SARS-CoV-2 generated higher levels of intracellular viral RNA, but strikingly about 50-fold less infectious viral progeny was recovered from the culture medium. Immunofluorescence microscopy of SARS-CoV-2-infected cells established extensive cross-reactivity of antisera previously raised against a variety of non-structural proteins, membrane and nucleocapsid protein of SARS-CoV. Electron microscopy revealed that the ultrastructural changes induced by the two SARS viruses are very similar and occur within comparable time frames after infection. Furthermore, we determined that the sensitivity of the two viruses to three established inhibitors of coronavirus replication (remdesivir, alisporivir and chloroquine) is very similar, but that SARS-CoV-2 infection was substantially more sensitive to pre-treatment of cells with pegylated interferon alpha. An important difference between the two viruses is the fact that – upon passaging in Vero E6 cells – SARS-CoV-2 apparently is under strong selection pressure to acquire adaptive mutations in its spike protein gene. These mutations change or delete a putative furin-like cleavage site in the region connecting the S1 and S2 domains and result in a very prominent phenotypic change in plaque assays.

ABSTRACT The sudden emergence of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) at the end of 2019 from the Chinese province of Hubei and its subsequent pandemic spread highlight the importance of understanding the full molecular details of coronavirus infection and pathogenesis. Here, we compared a variety of replication features of SARS-CoV-2 and SARS-CoV and analysed the cytopathology caused by the two closely related viruses in the commonly used Vero E6 cell line. Compared to SARS-CoV, SARS-CoV-2 generated higher levels of intracellular viral RNA, but strikingly about 50-fold less infectious viral progeny was recovered from the culture medium. Immunofluorescence microscopy of SARS-CoV-2-infected cells established extensive cross-reactivity of antisera previously raised against a variety of nonstructural proteins, membrane and nucleocapsid protein of SARS-CoV. Electron microscopy revealed that the ultrastructural changes induced by the two SARS viruses are very similar and occur within comparable time frames after infection. Furthermore, we determined that the sensitivity of the two viruses to three established inhibitors of coronavirus replication (Remdesivir, Alisporivir and chloroquine) is very similar, but that SARS-CoV-2 infection was substantially more sensitive to pre-treatment of cells with pegylated interferon alpha. An important difference between the two viruses is the fact that - upon passaging in Vero E6 cells - SARS-CoV-2 apparently is under strong selection pressure to acquire adaptive mutations in its spike protein gene. These mutations change or delete a putative ‘furin-like cleavage site’ in the region connecting the S1 and S2 domains and result in a very prominent phenotypic change in plaque assays.

Abstract Development of effective preventative interventions against SARS-CoV-2, the etiologic agent of COVID-19 is urgently needed. The viral surface spike (S) protein of SARS-CoV-2 is a key target for prophylactic measures as it is critical for the viral replication cycle and the primary target of neutralizing antibodies. We evaluated design elements previously shown for other coronavirus S protein-based vaccines to be successful, e.g. prefusion-stabilizing substitutions and heterologous signal peptides, for selection of a S-based SARS-CoV-2 vaccine candidate. In vitro characterization demonstrated that the introduction of stabilizing substitutions (i.e., furin cleavage site mutations and two consecutive prolines in the hinge region of S1) increased the ratio of neutralizing versus non-neutralizing antibody binding, suggestive for a prefusion conformation of the S protein. Furthermore, the wild type signal peptide was best suited for the correct cleavage needed for a natively-folded protein. These observations translated into superior immunogenicity in mice where the Ad26 vector encoding for a membrane-bound stabilized S protein with a wild type signal peptide elicited potent neutralizing humoral immunity and cellular immunity that was polarized towards Th1 IFN-γ. This optimized Ad26 vector-based vaccine for SARS-CoV-2, termed Ad26.COV2.S, is currently being evaluated in a phase I clinical trial (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04436276 ).

Abstract Safe and effective coronavirus disease (COVID)-19 vaccines are urgently needed to control the ongoing pandemic. While single-dose vaccine regimens would provide multiple advantages, two doses may improve the magnitude and durability of immunity and protective efficacy. We assessed one- and two-dose regimens of the Ad26.COV2.S vaccine candidate in adult and aged non-human primates (NHP). A two-dose Ad26.COV2.S regimen induced higher peak binding and neutralizing antibody responses compared to a single dose. In one-dose regimens neutralizing antibody responses were stable for at least 14 weeks, providing an early indication of durability. Ad26.COV2.S induced humoral immunity and Th1 skewed cellular responses in aged NHP that were comparable to adult animals. Importantly, aged Ad26.COV2.S-vaccinated animals challenged 3 months post -dose 1 with a SARS-CoV-2 spike G614 variant showed near complete lower and substantial upper respiratory tract protection for both regimens. These are the first NHP data showing COVID-19 vaccine protection against the SARS-CoV-2 spike G614 variant and support ongoing clinical Ad26.COV2.S development. Summary COVID-19 vaccines are urgently needed and while single-dose vaccines are preferred, two-dose regimens may improve efficacy. We show improved Ad26.COV2.S immunogenicity in non-human primates after a second vaccine dose, while both regimens protected aged animals against SARS-CoV-2 disease.

ABSTRACT Previously we have shown that a single dose of recombinant adenovirus serotype 26 (Ad26) vaccine expressing a prefusion stabilized SARS-CoV-2 spike antigen (Ad26.COV2.S) is immunogenic and provides protection in Syrian hamster and non-human primate SARS-CoV-2 infection models. Here, we investigated the immunogenicity, protective efficacy and potential for vaccine-associated enhanced respiratory disease (VAERD) mediated by Ad26.COV2.S in a moderate disease Syrian hamster challenge model, using the currently most prevalent G614 spike SARS-CoV-2 variant. Vaccine doses of 1×10 9 vp and 1×10 10 vp elicited substantial neutralizing antibodies titers and completely protected over 80% of SARS-CoV-2 inoculated Syrian hamsters from lung infection and pneumonia but not upper respiratory tract infection. A second vaccine dose further increased neutralizing antibody titers which was associated with decreased infectious viral load in the upper respiratory tract after SARS-CoV-2 challenge. Suboptimal non-protective immune responses elicited by low-dose A26.COV2.S vaccination did not exacerbate respiratory disease in SARS-CoV-2-inoculated Syrian hamsters with breakthrough infection. In addition, dosing down the vaccine allowed to establish that binding and neutralizing antibody titers correlate with lower respiratory tract protection probability. Overall, these pre-clinical data confirm efficacy of a 1-dose vaccine regimen with Ad26.COV2.S in this G614 spike SARS-CoV-2 virus variant Syrian hamster model, show the added benefit of a second vaccine dose, and demonstrate that there are no signs of VAERD under conditions of suboptimal immunity.

Abstract Understanding the mechanisms and impact of booster vaccinations can facilitate decisions on vaccination programmes. This study shows that three doses of the same synthetic peptide vaccine eliciting an exclusive CD8 + T cell response against one SARS-CoV-2 Spike epitope protected all mice against lethal SARS-CoV-2 infection in the K18-hACE2 transgenic mouse model in the absence of neutralizing antibodies, while only a second vaccination with this T cell vaccine was insufficient to provide protection. The third vaccine dose of the single T cell epitope peptide resulted in superior generation of effector-memory T cells in the circulation and tissue-resident memory T (T RM ) cells, and these tertiary vaccine-specific CD8 + T cells were characterized by enhanced polyfunctional cytokine production. Moreover, fate mapping showed that a substantial fraction of the tertiary effector-memory CD8 + T cells developed from remigrated T RM cells. Thus, repeated booster vaccinations quantitatively and qualitatively improve the CD8 + T cell response leading to protection against otherwise lethal SARS-CoV-2 infection. Summary A third dose with a single T cell epitope-vaccine promotes a strong increase in tissue-resident memory CD8 + T cells and fully protects against SARS-CoV-2 infection, while single B cell epitope-eliciting vaccines are unable to provide protection.

Human coronavirus 229E (HCoV-229E) is associated with upper respiratory tract infections and generally causes mild respiratory symptoms. HCoV-229E infection can cause cell death, but the molecular pathways that lead to virus-induced cell death as well as the interplay between viral proteins and cellular cell death effectors remain poorly characterized for HCoV-229E. Studying how HCoV-229E and other common cold coronaviruses interact with and affect cell death pathways may help to understand its pathogenesis and compare it to that of highly pathogenic coronaviruses. Here, we report that the main protease (Mpro) of HCoV-229E can cleave gasdermin D (GSDMD) at two different sites (Q29 and Q193) within its active N-terminal domain to generate fragments that are now unable to cause pyroptosis, a form of lytic cell death normally executed by this protein. Despite GSDMD cleavage by HCoV-229E Mpro, we show that HCoV-229E infection still leads to lytic cell death. We demonstrate that during virus infection caspase-3 cleaves and activates gasdermin E (GSDME), another key executioner of pyroptosis. Accordingly, GSDME knockout cells show a significant decrease in lytic cell death upon virus infection. Finally, we show that HCoV-229E infection leads to increased lytic cell death levels in cells expressing a GSDMD mutant uncleavable by Mpro (GSDMD Q29A+Q193A). We conclude that GSDMD is inactivated by Mpro during HCoV-229E infection, preventing GSDMD-mediated cell death, and point to the caspase-3/GSDME axis as an important player in the execution of virus-induced cell death. In the context of similar reported findings for highly pathogenic coronaviruses, our results suggest that these mechanisms do not contribute to differences in pathogenicity among coronaviruses. Nonetheless, understanding the interactions of common cold-associated coronaviruses and their proteins with the programmed cell death machineries may lead to new clues for coronavirus control strategies.

Abstract Human coronavirus 229E (HCoV-229E) is associated with upper respiratory tract infections and causes local respiratory symptoms. It has been reported that HCoV-229E can cause cell death in a variety of cells in vitro . However, the molecular pathways that lead to virus-induced cell death remain poorly characterized. Here, we show that the main protease (Mpro) of HCoV-229E can cleave the pyroptosis executioner gasdermin D (GSDMD) within its active N-terminal domain at two different sites (Q29 and Q193) to generate fragments unable to cause pyroptosis. Despite GSDMD cleavage by HCoV-229E Mpro, we show that HCoV-229E infection leads to lytic cell death. We further demonstrate that virus-induced lytic cell death is partially dependent on the activation of caspases-3 and -8. Interestingly, inhibition of caspases does not only reduce lytic cell death upon infection, but also sustains the release of virus particles over time, which suggests that caspase-mediated cell death is a mechanism to limit virus replication and spread. Finally, we show that pyroptosis is partially dependent on another gasdermin family member, gasdermin E (GSDME). During HCoV-229E infection, GSDME is cleaved to yield its N-terminal pore-forming domain (p30). Accordingly, GSDME knockout cells show a significant decrease in lytic cell death upon virus, whereas this is not the case for GSDMD knockout cells, which aligns with the observation that GSDMD is also inactivated by caspase-3 during infection. These results suggest that GSDMD is inactivated during HCoV-229E infection, and point to GSDME as an important player in the execution of virus-induced cell death. Importance Recently, it has been shown that the Mpros of coronaviruses possess accessory functions other than their main role in the proteolytic processing of the viral polyproteins. Although the SARS-CoV-2 outbreak has fuelled the discovery of host cellular substrates of SARS-CoV-2 Mpro, less is known about the interplay of less pathogenic human coronavirus Mpros with host proteins. We demonstrate that HCoV-229E Mpro cleaves GSDMD at two sites within its pore-forming domain, which disrupts GSDMD-mediated pyroptosis. These results point to a new strategy for HCoV-229E to escape the host antiviral response. Additionally, we show that GSDME contributes to virus-induced lytic cell death upon activation by caspase-3, shedding light on a previously undescribed cell death mechanism occurring in HCoV-229E infected cells.

The SARS-CoV-2 pandemic and the emergence of novel virus variants have had a dramatic impact on public health and the world economy, underscoring the need for detailed studies that explore the high efficacy of additional vaccines in animal models. In this study, we confirm the pathogenicity of the SARS-CoV-2/Leiden_008 isolate (GenBank accession number MT705206.1) in K18-hACE2 transgenic mice. Using this isolate, we show that a vaccine consisting of capsid virus-like particles (cVLPs) displaying the receptor-binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 (Wuhan strain) induces strong neutralizing antibody responses and sterilizing immunity in K18-hACE2 mice. Furthermore, we demonstrate that vaccination with the RBD-cVLP vaccine protects mice from both a lethal infection and symptomatic disease. Our data also indicate that immunization significantly reduces inflammation and lung pathology associated with severe disease in mice. Additionally, we show that the survival of naïve animals significantly increases when sera from animals vaccinated with RBD-cVLP are passively transferred, prior to a lethal virus dose. Finally, the RBD-cVLP vaccine has a similar antigen composition to the clinical ABNCOV2 vaccine, which has shown non-inferiority to the Comirnaty mRNA vaccine in phase I-III trials. Therefore, our study provides evidence that this vaccine design is highly immunogenic and confers full protection against severe disease in mice.