Multiple sclerosis (MS) is a heterogenous autoimmune disease in which autoreactive lymphocytes attack the myelin sheath of the central nervous system. B lymphocytes in the cerebrospinal fluid (CSF) of patients with MS contribute to inflammation and secrete oligoclonal immunoglobulins1,2. Epstein-Barr virus (EBV) infection has been epidemiologically linked to MS, but its pathological role remains unclear3. Here we demonstrate high-affinity molecular mimicry between the EBV transcription factor EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) and the central nervous system protein glial cell adhesion molecule (GlialCAM) and provide structural and in vivo functional evidence for its relevance. A cross-reactive CSF-derived antibody was initially identified by single-cell sequencing of the paired-chain B cell repertoire of MS blood and CSF, followed by protein microarray-based testing of recombinantly expressed CSF-derived antibodies against MS-associated viruses. Sequence analysis, affinity measurements and the crystal structure of the EBNA1-peptide epitope in complex with the autoreactive Fab fragment enabled tracking of the development of the naive EBNA1-restricted antibody to a mature EBNA1-GlialCAM cross-reactive antibody. Molecular mimicry is facilitated by a post-translational modification of GlialCAM. EBNA1 immunization exacerbates disease in a mouse model of MS, and anti-EBNA1 and anti-GlialCAM antibodies are prevalent in patients with MS. Our results provide a mechanistic link for the association between MS and EBV and could guide the development of new MS therapies.

Abstract Deep sequencing of B cell receptor (BCR) heavy chains from a cohort of 19 COVID-19 patients from the UK reveals a stereotypical naive immune response to SARS-CoV-2 which is consistent across patients and may be a positive indicator of disease outcome. Clonal expansion of the B cell memory response is also observed and may be the result of memory bystander effects. There was a strong convergent sequence signature across patients, and we identified 777 clonotypes convergent between at least four of the COVID-19 patients, but not present in healthy controls. A subset of the convergent clonotypes were homologous to known SARS and SARS-CoV-2 spike protein neutralising antibodies. Convergence was also demonstrated across wide geographies by comparison of data sets between patients from UK, USA and China, further validating the disease association and consistency of the stereotypical immune response even at the sequence level. These convergent clonotypes provide a resource to identify potential therapeutic and prophylactic antibodies and demonstrate the potential of BCR profiling as a tool to help understand and predict positive patient responses.

Abstract Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) has an extremely poor prognosis. Understanding the multiple mechanisms by which the tumour evades immune control, and how these mechanisms may be disrupted is critical to developing targeted immunotherapies. Previous studies have shown that higher lymphocyte infiltration is associated with better survival, and here we investigated what mediates these differences. We performed a comprehensive analysis of PDAC-associated immune cells using single cell multi-omics coupled with re-analysis of public PDAC scRNA-seq datasets. We introduce novel single-cell and repertoire analyses that have uncoupled diverse roles and contributions of various immune cell populations within different tumour microenvironments (TMEs). They revealed clear distinctions in the clonal characteristics among different patient groups, provided valuable insights into the mechanisms of immune cell migration and tissue adaptation underlying these disparities. These results point to differential CD4 polarisation of intra-tumoural T cells, differential B cell differentiation, GC reactions, antigen presentation pathways, and distinct cell-cell communication between the myeloid-enriched and adaptive-enriched groups. Overall, we identified two major distinct themes for future immune intervention within PDAC patients between those with higher adaptive versus myeloid immune cell infiltration.

Abstract Driven by the necessity to survive environmental pathogens, the human immune system has evolved exceptional diversity and plasticity, to which several factors contribute including inheritable structural polymorphism of the underlying genes. Characterizing this variation is challenging due to the complexity of these loci, which contain extensive regions of paralogy, segmental duplication and high copy-number repeats, but recent progress in long-read sequencing and optical mapping techniques suggests this problem may now be tractable. Here we assess this by using long-read sequencing platforms from PacBio and Oxford Nanopore, supplemented with short-read sequencing and Bionano optical mapping, to sequence DNA extracted from CD14 + monocytes and peripheral blood mononuclear cells from a single European individual identified as HV31. We use this data to build a de novo assembly of eight genomic regions encoding four key components of the immune system, namely the human leukocyte antigen, immunoglobulins, T cell receptors, and killer-cell immunoglobulin-like receptors. Validation of our assembly using k-mer based and alignment approaches suggests that it has high accuracy, with estimated base-level error rates below 1 in 10 kb, although we identify a small number of remaining structural errors. We use the assembly to identify heterozygous and homozygous structural variation in comparison to GRCh38. Despite analyzing only a single individual, we find multiple large structural variants affecting core genes at all three immunoglobulin regions and at two of the three T cell receptor regions. Several of these variants are not accurately callable using current algorithms, implying that further methodological improvements are needed. Our results demonstrate that assessing haplotype variation in these regions is possible given sufficiently accurate long-read and associated data; application of these methods to larger samples would provide a broader catalogue of germline structural variation at these loci, an important step toward making these regions accessible to large-scale genetic association studies.

Abstract A 2-day closed workshop was held in Liverpool, United Kingdom, to discuss the results of research concerning symptom-based disorders (SBDs) caused by autoantibodies, share technical knowledge, and consider future plans. Twenty-two speakers and 14 additional participants attended. This workshop set out to consolidate knowledge about the contribution of autoantibodies to SBDs. Persuasive evidence for a causative role of autoantibodies in disease often derives from experimental “ passive transfer ” approaches, as first established in neurological research. Here, serum immunoglobulin (IgM or IgG) is purified from donated blood and transferred to rodents, either systemically or intrathecally. Rodents are then assessed for the expression of phenotypes resembling the human condition; successful phenotype transfer is considered supportive of or proof for autoimmune pathology. Workshop participants discussed passive transfer models and wider evidence for autoantibody contribution to a range of SBDs. Clinical trials testing autoantibody reduction were presented. Cornerstones of both experimental approaches and clinical trial parameters in this field were distilled and presented in this article. Mounting evidence suggests that immunoglobulin transfer from patient donors often induces the respective SBD phenotype in rodents. Understanding antibody binding epitopes and downstream mechanisms will require substantial research efforts, but treatments to reduce antibody titres can already now be evaluated.

Abstract Pancreatic cancer has the worst prognosis of any human malignancy and leukocyte infiltration is a major prognostic marker of the disease. As current immunotherapies confer negligible survival benefits, there is a need to better characterise leukocytes in pancreatic cancer to identify better therapeutic strategies. In this study, we analysed 32 human pancreatic cancer patients from two independent cohorts. A multi-parameter mass-cytometry analysis was performed on 32,000 T-cells from eight patients. Single-cell RNA sequencing dataset analysis was performed on a cohort of 24 patients. Multiplex immunohistochemistry imaging and spatial analysis were performed to map immune infiltration into the tumour microenvironment. Regulatory T-cell populations demonstrated highly immunosuppressive states with high TIGIT, ICOS and CD39 expression. CD8 + T-cells were found to be either in senescence or an exhausted state. The exhausted CD8 T-cells had low PD-1 expression but high TIGIT and CD39 expression. These findings were corroborated in an independent pancreatic cancer single-cell RNA dataset from additional 24 patients. These data suggest that T-cells are major players in the suppressive microenvironment of pancreatic cancer. Our work identifies novel therapeutic targets that should form the basis for rational design of a new generation of clinical trials in pancreatic ductal adenocarcinoma.

Abstract Sequencing studies of Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL) have identified hundreds of recurrently altered genes. However, it remains largely unknown whether and how these mutations may contribute to lymphomagenesis, either individually or in combination. Existing strategies to address this problem predominantly utilize cell lines, which are limited by their initial characteristics and subsequent adaptions to prolonged in vitro culture. Here, we describe a novel co-culture system that enables the ex vivo expansion and viral transduction of primary human germinal center B cells. The incorporation of CRISPR/Cas9 technology enables high-throughput functional interrogation of genes recurrently mutated in DLBCL. Using a backbone of BCL2 with either BCL6 or MYC we have identified co-operating oncogenes that promote growth and survival, or even full transformation into synthetically engineered models of DLBCL. The resulting tumors can be expanded and sequentially transplanted in vivo , providing a scalable platform to test putative cancer genes and for the creation of mutation-directed, bespoke lymphoma models.

Abstract Loss-of-function mutations in the gene encoding the acetyltransferase CREBBP have been reported in numerous cancers but are particularly frequent in lymphoid malignancies. However, the functional significance of CREBBP loss in transformation and disease progression, most likely through cooperation with secondary genetic hits, has not yet been fully unravelled. Similarly, the contribution of the initial cell population sustaining CREBBP loss in the course of disease remains elusive. Here, we developed a new lymphoma mouse model integrating Crebbp loss at various stages of B cell development with a transposon-based insertional mutagenesis system. We demonstrated that Crebbp loss from the HSPC compartment resulted in an aggressive DLBCL-like disease, recapitulating well-characterised histological and molecular features of the human disease, as well as the recently described enhanced CD24 expression. More importantly, we identified candidate genes functionally equivalent to patient mutated genes. Those genes, mainly related to B cell development and cellular signalling, may represent novel therapeutic targets. Overall, this new model provides a powerful resource in which to conduct future mechanistic and therapeutic studies.

The immunosuppressive microenvironment in PDAC prevents tumor control but strategies to restore anti-cancer immunology, by increasing CD8 T cell activity, have not been successful. Here we demonstrate how inducing localized physical damage using ionizing radiation (IR) unmasks the benefit of immunotherapy by increasing tissue-resident NK (trNK) cells that support CD8 T activity. Our data confirms that targeting mouse orthotopic PDAC tumors with IR together with CCR5 inhibition and PD1 blockade reduces E-cadherin positive tumor cells by recruiting a hypofunctional NKG2C-ve NK population that supports CD8 T cell involvement. We show an equivalent population in human PDAC cohorts that represents an adaptive-like immunomodulatory trNK-cell that similarly supports CD8 T cell levels in a cDC1-dependent manner. Importantly, a trNK signature associates with survival in PDAC and solid malignancies revealing a potential beneficial role for trNK in improving adaptive anti-tumor responses and supporting CCR5i/αPD1 and IR-induced damage as a novel therapeutic approach.