Many genetic variations are single nucleotide polymorphisms (SNPs). Non-synonymous SNPs are ‘neutral’ if the resulting point-mutated protein is not functionally discernible from the wild type and ‘non-neutral’ otherwise. The ability to identify non-neutral substitutions could significantly aid targeting disease causing detrimental mutations, as well as SNPs that increase the fitness of particular phenotypes. Here, we introduced comprehensive data sets to assess the performance of methods that predict SNP effects. Along we introduced SNAP (screening for non- a cceptable p olymorphisms), a neural network-based method for the prediction of the functional effects of non-synonymous SNPs. SNAP needs only sequence information as input, but benefits from functional and structural annotations, if available. In a cross-validation test on over 80 000 mutants, SNAP identified 80% of the non-neutral substitutions at 77% accuracy and 76% of the neutral substitutions at 80% accuracy. This constituted an important improvement over other methods; the improvement rose to over ten percentage points for mutants for which existing methods disagreed. Possibly even more importantly SNAP introduced a well-calibrated measure for the reliability of each prediction. This measure will allow users to focus on the most accurate predictions and/or the most severe effects. Available at http://www.rostlab.org/services/SNAP

PredictProtein is a meta-service for sequence analysis that has been predicting structural and functional features of proteins since 1992. Queried with a protein sequence it returns: multiple sequence alignments, predicted aspects of structure (secondary structure, solvent accessibility, transmembrane helices (TMSEG) and strands, coiled-coil regions, disulfide bonds and disordered regions) and function. The service incorporates analysis methods for the identification of functional regions (ConSurf), homology-based inference of Gene Ontology terms (metastudent), comprehensive subcellular localization prediction (LocTree3), protein–protein binding sites (ISIS2), protein–polynucleotide binding sites (SomeNA) and predictions of the effect of point mutations (non-synonymous SNPs) on protein function (SNAP2). Our goal has always been to develop a system optimized to meet the demands of experimentalists not highly experienced in bioinformatics. To this end, the PredictProtein results are presented as both text and a series of intuitive, interactive and visually appealing figures. The web server and sources are available at http://ppopen.rostlab.org.

Elucidating the effects of naturally occurring genetic variation is one of the major challenges for personalized health and personalized medicine. Here, we introduce SNAP2, a novel neural network based classifier that improves over the state-of-the-art in distinguishing between effect and neutral variants. Our method's improved performance results from screening many potentially relevant protein features and from refining our development data sets. Cross-validated on >100k experimentally annotated variants, SNAP2 significantly outperformed other methods, attaining a two-state accuracy (effect/neutral) of 83%. SNAP2 also outperformed combinations of other methods. Performance increased for human variants but much more so for other organisms. Our method's carefully calibrated reliability index informs selection of variants for experimental follow up, with the most strongly predicted half of all effect variants predicted at over 96% accuracy. As expected, the evolutionary information from automatically generated multiple sequence alignments gave the strongest signal for the prediction. However, we also optimized our new method to perform surprisingly well even without alignments. This feature reduces prediction runtime by over two orders of magnitude, enables cross-genome comparisons, and renders our new method as the best solution for the 10-20% of sequence orphans. SNAP2 is available at: https://rostlab.org/services/snap2web Delta, input feature that results from computing the difference feature scores for native amino acid and feature scores for variant amino acid; nsSNP, non-synoymous SNP; PMD, Protein Mutant Database; SNAP, Screening for non-acceptable polymorphisms; SNP, single nucleotide polymorphism; variant, any amino acid changing sequence variant.

Abstract Understanding the molecular evolution of the SARS‐CoV‐2 virus as it continues to spread in communities around the globe is important for mitigation and future pandemic preparedness. Three‐dimensional structures of SARS‐CoV‐2 proteins and those of other coronavirusess archived in the Protein Data Bank were used to analyze viral proteome evolution during the first 6 months of the COVID‐19 pandemic. Analyses of spatial locations, chemical properties, and structural and energetic impacts of the observed amino acid changes in >48 000 viral isolates revealed how each one of 29 viral proteins have undergone amino acid changes. Catalytic residues in active sites and binding residues in protein–protein interfaces showed modest, but significant, numbers of substitutions, highlighting the mutational robustness of the viral proteome. Energetics calculations showed that the impact of substitutions on the thermodynamic stability of the proteome follows a universal bi‐Gaussian distribution. Detailed results are presented for potential drug discovery targets and the four structural proteins that comprise the virion, highlighting substitutions with the potential to impact protein structure, enzyme activity, and protein–protein and protein–nucleic acid interfaces. Characterizing the evolution of the virus in three dimensions provides testable insights into viral protein function and should aid in structure‐based drug discovery efforts as well as the prospective identification of amino acid substitutions with potential for drug resistance.

Abstract Since 1992 PredictProtein ( https://predictprotein.org ) is a one-stop online resource for protein sequence analysis with its main site hosted at the Luxembourg Centre for Systems Biomedicine (LCSB) and queried monthly by over 3,000 users in 2020. PredictProtein was the first Internet server for protein predictions. It pioneered combining evolutionary information and machine learning. Given a protein sequence as input, the server outputs multiple sequence alignments, predictions of protein structure in 1D and 2D (secondary structure, solvent accessibility, transmembrane segments, disordered regions, protein flexibility, and disulfide bridges) and predictions of protein function (functional effects of sequence variation or point mutations, Gene Ontology (GO) terms, subcellular localization, and protein-, RNA-, and DNA binding). PredictProtein’s infrastructure has moved to the LCSB increasing throughput; the use of MMseqs2 sequence search reduced runtime five-fold; user interface elements improved usability, and new prediction methods were added. PredictProtein recently included predictions from deep learning embeddings (GO and secondary structure) and a method for the prediction of proteins and residues binding DNA, RNA, or other proteins. PredictProtein.org aspires to provide reliable predictions to computational and experimental biologists alike. All scripts and methods are freely available for offline execution in high-throughput settings. Availability Freely accessible webserver PredictProtein.org ; Source and docker images: github.com/rostlab

ABSTRACT Determining the repertoire of a microbe’s molecular functions is a central question in microbial biology. Modern techniques achieve this goal by comparing microbial genetic material against reference databases of functionally annotated genes/proteins or known taxonomic markers such as 16S rRNA. Here we describe a novel approach to exploring bacterial functional repertoires without reference databases. Our Fusion scheme establishes functional relationships between bacteria and assigns organisms to Fusion-taxa that differ from otherwise defined taxonomic clades. Three key findings of our work stand out. First, bacterial functional comparisons outperform marker genes in assigning taxonomic clades. Fusion profiles are also better for this task than other functional annotation schemes. Second, Fusion-taxa are robust to addition of novel organisms and are, arguably, able to capture the environment-driven bacterial diversity. Finally, our alignment-free nucleic acid-based Siamese Neural Network model, created using Fusion functions, enables finding shared functionality of very distant, possibly structurally different, microbial homologs. Our work can thus help annotate functional repertoires of bacterial organisms and further guide our understanding of microbial communities.

In silico functional annotation of proteins is crucial to narrowing the sequencing-accelerated gap in our understanding of protein activities. Numerous function annotation methods exist, and their ranks have been growing, particularly so with the recent deep learning-based developments. However, it is unclear if these tools are truly predictive. As we are not aware of any methods that can identify new terms in functional ontologies, we ask if they can, at least, identify molecular functions of new protein sequences that are non-homologous to or far-removed from known protein families. Here, we explore the potential and limitations of the existing methods in predicting molecular functions of thousands of such orphan proteins. Lacking the ground truth functional annotations, we transformed the assessment of function prediction into evaluation of functional similarity of orphan siblings, i.e. pairs of proteins that likely share function, but that are unlike any of the currently functionally annotated sequences. Notably, our approach transcends the limitations of functional annotation vocabularies and provides a platform to compare different methods without the need for mapping terms across ontologies. We find that most existing methods are limited to identifying functional similarity of homologous sequences and are thus descriptive, rather than predictive of function. Curiously, despite their seemingly unlimited by-homology scope, novel deep learning methods also remain far from capturing functional signal encoded in protein sequence. We believe that our work will inspire the development of a new generation of methods that push our knowledge boundaries and promote exploration and discovery in the molecular function domain.

Evaluating the impact of non-synonymous genetic variants is essential for uncovering disease associations and mechanisms of evolution. Understanding corresponding sequence changes is also fundamental for synthetic protein design and stability assessments. However, the performance gain of variant effect predictors observed in recent years is not in line with the increased complexity of new methods. One likely reason for this might be that most approaches use similar sets of gene/protein features for modeling variant effect, often emphasizing sequence conservation. While high levels of conservation highlight residues essential for protein activity, much of the in vivo observable variation is arguably weaker in its impact and, thus, requires evaluation at a higher level of resolution. Here we describe fu nction N eutral/ T oggle/ R heostat p redictor ( funtrp ), a novel computational method that categorizes protein positions based on the position-specific expected range of mutational impacts: Neutral (weak/no effects), Rheostat (function-tuning positions), or Toggle (on/off switches). We show that position types do not correlate strongly with familiar protein features such as conservation or protein disorder. We also find that position type distribution varies across different protein functions. Finally, we demonstrate that position types reflect experimentally determined functional effects and can thus improve performance of existing variant effect predictors and suggest a way forward for the development of new ones.

ABSTRACT Synonymous single nucleotide variants (sSNVs) are common in the human genome but are often overlooked. However, sSNVs can have significant biological impact and may lead to disease. Existing computational methods for evaluating the effect of sSNVs suffer from the lack of gold-standard training/evaluation data and exhibit over-reliance on sequence conservation signals. We developed synVep (synonymous Variant effect predictor), a machine learning-based method that overcomes both of these limitations. Our training data was a combination of variants reported by gnomAD (observed) and those unreported, but possible in the human genome (generated). We used positive-unlabeled learning to purify the generated variant set of any likely unobservable variants. We then trained two sequential extreme gradient boosting models to identify subsets of the remaining variants putatively enriched and depleted in effect. Our method attained 90% precision/recall on a previously unseen set of variants. Furthermore, although synVep does not explicitly use conservation, its scores correlated with evolutionary distances between orthologs in cross-species variation analysis. synVep was also able to differentiate pathogenic vs. benign variants, as well as splice-site disrupting variants (SDV) vs. non-SDVs. Thus, synVep provides an important improvement in annotation of sSNVs, allowing users to focus on variants that most likely harbor effects.

Abstract Functional metagenomics enables the study of unexplored bacterial diversity, gene families, and pathways essential to microbial communities. However, discovering biological insights with these data is impeded by the scarcity of quality annotations. Here, we use a co-occurrence-based analysis of predicted microbial protein functions to uncover pathways in genomic and metagenomic biological systems. Our approach, based on phylogenetic profiles, improves the identification of functional relationships, or participation in the same biochemical pathway, between enzymes over a comparable homology-based approach. We optimized the design of our profiles to identify potential pathways using minimal data, clustered functionally related enzyme pairs into multi-enzymatic pathways, and evaluated our predictions against reference pathways in KEGG. We then demonstrated a novel extension of this approach to predict inter-bacterial protein interactions amongst members of a marine microbiome. Most significantly, we show our method predicts emergent biochemical pathways between known and unknown functions. Thus, our work establishes a basis for identifying the potential functional capacities of the entire metagenome, capturing previously unknown and abstract functions into discrete putative pathways.