Abstract Transcription is silent during the mammalian oocyte-to-embryo transition (OET) until zygotic genome activation (ZGA). Therefore, the OET relies on post-transcriptional regulation of maternal mRNA, among which poly(A) tail lengths have been found to regulate translation for a small number of genes 1–3 . However, transcriptome-wide poly(A) tail length dynamics and their role in gene expression during the mammalian OET remain unknown. Here, we quantified transcriptome-wide mRNA poly(A) tail length dynamics during the mammalian OET using PAIso-seq1 and PAIso-seq2 4,5 , two methods with different underlying principles that preserve the poly(A) tail information. We revealed that poly(A) tail length was highly dynamic during the mouse OET, and Btg4 is responsible for global maternal mRNA deadenylation. We found that the poly(A) tail length positively associated with translational efficiency transcriptome-wide in mouse oocytes. In addition, genes with different alternative polyadenylation isoforms show longer poly(A) tails for isoforms with distal polyadenylation sites compared to those with proximal polyadenylation sites in mouse, rat, pig and human oocytes after meiotic resumption, which is not seen in cultured cell lines. Surprisingly, mammalian embryos, namely mouse, rat, pig, and human embryos, all experience highly conserved global mRNA re-polyadenylation after fertilization, providing molecular evidence that the early embryo development before ZGA is driven by re-polyadenylated maternal mRNAs rather than newly transcribed mRNAs. Together, our study reveals the conserved mRNA poly(A) tail length landscape. This resource can be used for exploring spatiotemporal post-transcriptional regulation throughout the mammalian OET.

Abstract Non-templated poly(A) tails are added to the 3′-end of most mRNAs, which have important roles in post-transcriptional regulation 1–3 . Recent studies have revealed that poly(A) tails are not composed purely of A residues, but also contain U, C and G residues internally and at their 3′-ends 4–6 , revealing new levels of complexity. However, no method is able to analyze these internal and terminal non-A residues simultaneously. Here, we developed a new method called unbiased capture of 3-terminal followed by full-length RNA sequencing (UCTF-seq) which captures RNA 3′-ends by direct 3′ adaptor ligation and rRNA removal by CRISPR/Cas9. This method allows simultaneous evaluation of the poly(A) tail length and 5′-end, internal, and 3′-end non- A residues together with the full-length cDNA for a transcript. Applying this method, we achieved the first complete transcriptome-wide 3′ tail map of mRNA within the nuclear and cytoplasmic compartments of mammalian cells, uncovering differences in poly(A) tail length and non-A residues between these two mRNA populations. A survey of diverse eukaryotic species revealed the conservation of a subset of poly(A) tails containing consecutive U residues in the internal positions, whereas those with consecutive C or G residues were of much lower abundance. Together, we established the first method to be able to comprehensively analyze poly(A) tail 5′-end, internal and 3′-end non-A residues in addition to the length simultaneously, and reveal the first complete mRNA 3′ tail map, providing rich insights into the regulatory roles of poly(A) tails.

Abstract Non-A (U, G, and C) residues can be added to the 5’-end, internal, and 3’-end positions of poly(A) tails of RNA transcripts 1–3 , and some of these have been shown to regulate mRNA stability 4, 5 . The mammalian oocyte-to-embryo transition (OET) relies on post-transcriptional regulation of maternal RNA, because transcription is silent during this process until the point of zygotic genome activation (ZGA) 6–9 . Although the regulation of mRNA translation by poly(A) tail length plays an important role in the mammalian OET, the dynamics and functions of non-A residues in poly(A) tails are completely unknown. In this study, we profiled the genome-wide presence, abundance, and roles of non-A residues during the OET in mice using PAIso-seq1 and PAIso-seq2 2, 10 , two complementary methods of poly(A) tail analysis. We found that non-A residues are highly dynamic in maternal mRNA, following a general pattern of beginning to increase at the MII stage, becoming highly abundant after fertilization with U residues in about half of poly(A) tails in 1-cell embryos, and declining in 2-cell embryos. We revealed that Btg4-mediated global maternal mRNA deadenylation created the substrates for U residue addition by Tut4/7 at their 3’-ends and further re-polyadenylation. In addition, G residues can be added by Tent4a/b. Finally, we demonstrate that G residues stabilize the modified mRNA, while the U residues mark maternal RNA for faster degradation in 2-cell mouse embryos. Taken together, these findings demonstrate that non-A residues are abundant and re-sculpt the maternal transcriptome to initiate zygotic development, which reveals the functional importance of the post-transcriptional regulation mediated by non-A residues in mRNA poly(A) tails.

Abstract Poly(A) tail-mediated post-transcriptional regulation of maternal mRNA has been shown to be vital in the oocyte-to-embryo transition (OET) in flies, fish, frogs, and mice 1–8 . However, nothing is known about poly(A) tail dynamics for even a single gene during the human OET, because of the limited availability of human oocytes and embryos in combination with the low sensitivity of previous methods. Here, we systematically profiled the transcriptome-wide mRNA poly(A) tails in human oocytes at the germ-vesicle (GV), metaphase I (MI), and metaphase II (MII) stages, as well as pre-implantation embryos at the 1-cell (1C), 2-cell (2C), 4-cell (4C), 8-cell (8C), morula (MO), and blastocyst (BL) stages using single-oocyte/embryo PAIso-seq1 and PAIso-seq2 methods. We show that poly(A) tail length is highly dynamic during the OET, with BTG4 responsible for global deadenylation. Moreover, we reveal that non-A residues occur primarily in poly(A) tails of maternal RNA, which begin to increase at the MI stage, become highly abundant after fertilization (with U residues occurring in about two thirds, G residues in about one third, and C residues in about one fifth of mRNAs), and decline at the 8C stage. Importantly, we reveal that TUT4/7 can add U residues to deadenylated mRNA, which can then be re- polyadenylated to produce 5′-end and internal U residues. In addition, the re- polyadenylated mRNA can be stabilized through the addition of G residues by TENT4A/B. Finally, we demonstrate that U residues in poly(A) tails mark the maternal transcripts for quicker degradation in 8C human embryos compared to those without U residues. Together, our results not only reveal the dynamics of poly(A) tail length and non-A residues, but also provide mechanistic insights into the regulation of the length and the role of non-A residues during human OET. These findings further scientific understanding and open a new door for studying the human OET.

Abstract The nascent mRNA transcribed in the nucleus is cleaved and polyadenylated before it is transported to the cytoplasm for translation 1 . Polyadenylation can also occur in the cytoplasm for post-transcriptional regulation, especially in neurons, oocytes and early embryos 1,2 . Recently, we revealed transcriptome-wide maternal mRNA cytoplasmic re-polyadenylation during the mammalian oocyte-to-embryo transition (OET) 3-6 . However, the mechanism of re-polyadenylation during mammalian OET, including the sites to be re-polyadenylated and the enzymes involved, is still poorly understood. Here, by analyzing the PAIso-seq1 and PAIso-seq2 poly(A) inclusive transcriptome data during OET in mice, rats, pigs, and humans, we reveal conserved re-polyadenylation of mRNA degradation intermediates. These re-polyadenylated mRNA degradation intermediates account for over half of the polyadenylated mRNA during OET in all four species. We find that mRNA degradation intermediates for re-polyadenylation are generated through Btg4-mediated deadenylation in both mouse and human. Interestingly, the poly(A) tails on the re-polyadenylated mRNA degradation intermediates are of different lengths and contain different levels of non-A residues compared to regular polyadenylation sites, suggesting specific regulation and function of these poly(A) tails in mammalian OET. Together, our findings reveal the maternal mRNA degradation intermediates as substrates for conserved cytoplasmic dominant re-polyadenylation during mammalian OET, and uncover the mechanism of production of these mRNA degradation intermediates. These findings provide new insights into mRNA post-transcriptional regulation, and a new direction for the study of mammalian OET.

SUMMARY Poly(A) tail length and non-A residues are vital for oocyte-to-embryo transition (OET) in mice and humans 1–5 . However, the role of poly(A) tail length and non-A residues during OET in other commonly used mammalian animal models for human diseases remains unexplored. In addition, the degree of conservation in maternal mRNA poly(A) tail dynamics during OET across different mammal species is unknown. Here, we conduct a comparative analysis of the poly(A) tails during OET across four species: mice, rats, pigs, and humans. Dynamics during OET found to be conserved across all four species include: maternal mRNA deadenylation during oocyte maturation and re-polyadenylation after fertilization; a fall-rise trend in poly(A) tail length distribution; a rise-fall trend in the ratio of poly(A) tails with non-A residues; higher abundance of non-A residues in poly(A) tails of maternal mRNA than in zygotic genome activation (ZGA) mRNA; maternal mRNA with U residues degrades faster than those without U residues at the stage when ZGA takes place. While in mice and rats maternal mRNA deadenylation is impaired in parthenogenetic embryos and ZGA inhibition leads to blocked maternal mRNA deadenylation in mice and humans. In contrast, the length of consecutive U residues and the duration time of U residues in poly(A) tail diverges across the four species. Together, these findings reveal that the poly(A) tail mediated maternal mRNA post-transcriptional regulation is highly conserved in mammals with unique divergences in the length and life-span of U residues, providing new insights for the further understanding of OET across different mammals.

SUMMARY In vitro transcribed (IVT) mRNA represents a new class of drug in both therapeutics and vaccines. Improving the translation efficiency of IVT mRNA remains a core challenge for mRNA-based applications. Here, using IVT mRNAs with poly(A) tails containing non-A residues which were recently revealed to be widespread in RNA poly(A) tails 1,2 , we unexpectedly find that non-A residues can effectively promote the mRNA translation. To further support our finding, we provide evidence that non-A residues associated with enhanced mRNA translation efficiency transcriptome-wide in mouse and human cells. Together, our study provides a novel approach to enhance mRNA translation efficiency by inclusion of non-A residues in the mRNA poly(A) tails, holding great potential to promote mRNA-based therapeutics and vaccines.

Abstract RNA post-transcriptional regulation involves 5′-end capping, 3′ poly(A) tailing (including polyadenylation sites, tail length, and non-A residues 1, 2 ), alternative splicing, and chemical modifications including N 6 -methyladenosine (m 6 A) 3 . Studying the interplay of m 6 A, alternative splicing, alternative polyadenylation sites, poly(A) tail length, and non-A residues in poly(A) tails requires monitoring them simultaneously on one transcript, however strategies to achieve this are lacking. Therefore, we developed a new method, combining m 6 A-specific methylated RNA immunoprecipitation and the PacBio-based, tail-included, full-length RNA sequencing approach PAIso-seq2, which we’ve named m 6 A and poly(A) inclusive RNA isoform sequencing 2 (MePAIso-seq2). Using MePAIso-seq2, we revealed that m 6 A promotes and inhibits a similar number of alternative splicing events in mouse cell lines, showing that m 6 A does affect alternative splicing. In contrast, no correlation was detected between m 6 A and alternative polyadenylation sites choice. Surprisingly, we found that m 6 A-modified RNAs possess longer poly(A) tails and a lower proportion of poly(A) tails containing non-A residues, especially in mouse embryonic stem cells. Together, we developed a new method to detect full-length m 6 A-modified RNAs to comprehensively study the relationships between m 6 A, alternative splicing, and poly(A) tailing, laying a foundation for further exploration of the functional coordination of different RNA post-transcriptional modifications.

Abstract The normalization of high-throughput RNA sequencing (RNA-seq) data is needed to accurately analyze gene expression levels. Traditional normalization methods can either correct the differences in sequencing depth, or correct both the sequencing depth and other unwanted variations introduced during sequencing library preparation through exogenous spike-ins 1-4 . However, the exogenous spike-ins are prone to variation 5,6 . Therefore, a better normalization approach with a more appropriate reference is an ongoing demand. In this study, we demonstrated that mitochondrial mRNA (mRNA encoded by mitochondria genome) can serve as a steady endogenous reference for RNA-seq data analysis, and performs better than exogenous spike-ins. We also found that using mitochondrial mRNA as a reference can reduce batch effects for RNA-seq data. These results provide a simple and practical normalization strategy for RNA-seq data, which will serve as a valuable tool widely applicable to transcriptomic studies.

ABSTRACT The successful cell division involves highly regulated transcriptional and post-transcriptional control. Some of the cell cycle related genes are periodically expressed, while most of the genes show relatively stable steady state transcript level throughout the mitotic cell cycle (Bertoli et al., 2013; Park et al., 2016). Previous TAIL-seq analysis of S phase and M phase poly(A) tail information showed that less than 2% genes showed more than 2-fold change in their poly(A) tail length (Chang et al., 2014; Park et al., 2016). In addition, the changes in poly(A) tail length between these two stages showed minimal impact on the translation of the genes as long as the poly(A) tails were longer than 20 nt. Therefore, the significance of poly(A) tail dynamics during the cell cycle remains unknown. Here, by re-analyzing the S phase and M phase TAIL-seq data, we uncovered an interesting global dynamics of RNA poly(A) tails in terms of their terminal modifications, implying global RNA regulation between mitotic cell cycles through poly(A) tail terminal modifications.