New variants of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continue to arise and prolong the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. Here, we used a cell-free expression workflow to rapidly screen and optimize constructs containing multiple computationally designed miniprotein inhibitors of SARS-CoV-2. We found the broadest efficacy was achieved with a homotrimeric version of the 75-residue angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) mimic AHB2 (TRI2-2) designed to geometrically match the trimeric spike architecture. Consistent with the design model, in the cryo-electron microscopy structure TRI2-2 forms a tripod at the apex of the spike protein that engaged all three receptor binding domains simultaneously. TRI2-2 neutralized Omicron (B.1.1.529), Delta (B.1.617.2), and all other variants tested with greater potency than the monoclonal antibodies used clinically for the treatment of COVID-19. TRI2-2 also conferred prophylactic and therapeutic protection against SARS-CoV-2 challenge when administered intranasally in mice. Designed miniprotein receptor mimics geometrically arrayed to match pathogen receptor binding sites could be a widely applicable antiviral therapeutic strategy with advantages over antibodies in greater resistance to viral escape and antigenic drift, and advantages over native receptor traps in lower chances of autoimmune responses.

Abstract Antibody discovery is bottlenecked by the individual expression and evaluation of antigen-specific hits. Here, we address this gap by developing an automated workflow combining cell-free DNA template generation, protein synthesis, and high-throughput binding measurements of antibody fragments in a process that takes hours rather than weeks. We apply this workflow to 119 published SARS-CoV-2 neutralizing antibodies and demonstrate rapid identification of the most potent antibody candidates.

Escape variants of SARS-CoV-2 are threatening to prolong the COVID-19 pandemic. To address this challenge, we developed multivalent protein-based minibinders as potential prophylactic and therapeutic agents. Homotrimers of single minibinders and fusions of three distinct minibinders were designed to geometrically match the SARS-CoV-2 spike (S) trimer architecture and were optimized by cell-free expression and found to exhibit virtually no measurable dissociation upon binding. Cryo-electron microscopy (cryoEM) showed that these trivalent minibinders engage all three receptor binding domains on a single S trimer. The top candidates neutralize SARS-CoV-2 variants of concern with IC 50 values in the low pM range, resist viral escape, and provide protection in highly vulnerable human ACE2-expressing transgenic mice, both prophylactically and therapeutically. Our integrated workflow promises to accelerate the design of mutationally resilient therapeutics for pandemic preparedness.We designed, developed, and characterized potent, trivalent miniprotein binders that provide prophylactic and therapeutic protection against emerging SARS-CoV-2 variants of concern.

ABSTRACT Functional design of ribosomes with mutant ribosomal RNA (rRNA) could expand opportunities for understanding molecular translation, building cells from the bottom-up, and engineering ribosomes with altered capabilities. However, such efforts have been hampered by cell viability constraints, an enormous combinatorial sequence space, and limitations on large-scale, 3D design of RNA structures and functions. To address these challenges, we developed an integrated community science and experimental screening approach for rational design of ribosomes. This approach couples Eterna, an online video game that crowdsources RNA sequence design to community scientists in the form of puzzles, with in vitro ribosome synthesis, assembly, and translation in multiple design-build-test-learn cycles. We applied our framework to discover mutant rRNA sequences that improve protein synthesis in vitro and cell growth in vivo , relative to wild type ribosomes, under diverse environmental conditions. This work provides new insights into ribosome rRNA sequence-function relationships, with implications for synthetic biology.

Abstract The generation of haploids is one of the most powerful means to accelerate the plant breeding process. In most crop species, an efficient haploid technology is not yet available or only applicable to a limited set of genotypes. Recent results published for Arabidopsis thaliana and major cereal crops like maize and wheat about successful haploid induction by CRISPR/Cas9-mediated editing of the centromeric histone H3 gene (CENH3) suggest that this novel method for the production of haploid plants might also be applicable to vegetable species like carrot. Here, we report and summarize the different experimental and genetic approaches that have been focused in the past few years on CRISPR/Cas9-based editing of the carrot CENH3 gene. We also describe the discovery of a second CENH3 locus in the carrot genome, which complicates the attempts to generate and to analyse putative haploid inducer genotypes. We show that three different CRISPR/Cas9 target constructs, used alone or in combinations, could successfully target carrot CENH3. Promising mutants such as in-frame indel or in-frame deletion mutants have been found, but their successful usage as putative haploid inducer is uncertain yet. Next generation sequencing of amplicons spanning CRISPR target sites and transcript-based amplicon sequencing seemed to be appropriate methods to select promising mutants, to estimate mutation frequencies, and to allow a first prediction which gene was concerned. Another aim of this study was the simultaneous knockout and complementation of the endogenous carrot CENH3 gene by an alien CENH3 gene. Co-transformation of a CRISPR/Cas9-based carrot CENH3 knockout construct together with a CENH3 gene cloned from ginseng ( Panax ginseng ) was performed by using Rhizobium rhizogenes . It was shown, that ginseng CENH3 protein is accumulated inside the kinetochore region of carrot chromosomes, indicating that PgCENH3 might be a suited candidate for this approach. However, presently it is unclear, if this gene is fully functioning during the meiotic cell divisions and able to complement lethal gametes. Challenges and future prospects to develop a CENH3-based HI system for carrot are discussed.

Styrene is an important petroleum-derived molecule that is polymerized to make versatile plastics, including disposable silverware and foamed packaging materials. Finding more sustainable methods, such as biosynthesis, for producing styrene is essential due to the increasing severity of climate change as well as the limited supply of fossil fuels. Recent metabolic engineering efforts have enabled the biological production of styrene in Escherichia coli, but styrene toxicity and volatility limit biosynthesis in cells. To address these limitations, we have developed a cell-free styrene biosynthesis platform. The cell-free system provides an open reaction environment without cell viability constraints, which allows exquisite control over reaction conditions and greater carbon flux toward product formation rather than cell growth. The two biosynthetic enzymes required for styrene production were generated via cell-free protein synthesis and mixed in defined ratios with supplemented L-phenylalanine and buffer. By altering the time, temperature, pH, and enzyme concentrations in the reaction, this approach increased the cell-free titer of styrene from 5.36 +/- 0.63 mM to 40.33 +/- 1.03 mM, an order of magnitude greater than cellular synthesis methods. Cell-free systems offer a complimentary approach to cellular synthesis of small molecules, which can provide particular benefits for producing toxic molecules.

Gas fermentation by autotrophic bacteria, such as clostridia, offers a sustainable path to numerous bioproducts from a range of local, highly abundant, waste and low-cost feedstocks, such as industrial flue gases or syngas generated from biomass or municipal waste. Unfortunately, designing and engineering clostridia remains laborious and slow. The ability to prototype individual genetic parts, gene expression, and biosynthetic pathway performance in vitro before implementing them in cells could help address these bottlenecks by speeding up design. Unfortunately, a high-yielding cell-free gene expression (CFE) system from clostridia has yet to be developed. Here, we report the development and optimization of a high-yielding (236 ± 24 μg/mL) batch CFE platform from the industrially relevant anaerobe, Clostridium autoethanogenum. A key feature of the platform is that both circular and linear DNA templates can be applied directly to the CFE reaction to program protein synthesis. We demonstrate the ability to prototype gene expression, and quantitatively map cell-free metabolism in lysates from this system. We anticipate that the C. autoethanogenum CFE platform will not only expand the protein synthesis toolkit for synthetic biology, but also serve as a platform in expediting the screening and prototyping of gene regulatory elements in non-model, industrially relevant microbes.

Abstract Cell-free gene expression (CFE) systems are powerful tools for transcribing and translating genes outside of a living cell. Given their diverse roles in nature, synthesis of membrane proteins is of particular interest, but their yield in CFE is substantially lower than for soluble protein. In this paper, we study factors that affect the cell-free synthesis of membrane proteins and develop a quantitative kinetic model of their production. We identify that stalling of membrane protein translation on the ribosome is a strong predictor of membrane protein synthesis and creates a negative feedback loop in which stalled peptide sequences quench ribosome activity through aggregation between the ribosome nascent chains. Synthesis can be improved by the addition of lipid membranes which incorporate protein nascent chains and, therefore, kinetically competes with aggregation. Using both quantitative modeling and experiment, we show that the balance between peptide-membrane association and peptide aggregation rates determines the total yield of synthesized membrane protein. We then demonstrate that this balance can be shifted by altering membrane composition or the protein N-terminal domain sequence. Based on these findings, we define a membrane protein expression score that can be used to rationalize the engineering of N-terminal domain sequences both of a native and computationally designed membrane proteins produced through CFE.