Abstract Pendrin SLC26A4 is an anion exchanger expressed in apical membranes of selected epithelia. Pendrin ablation causes Pendred syndrome, a genetic disorder disease associated with sensorineural hearing loss, hypothyroid goiter, and reduced blood pressure. However, its molecular structure has remained unknown limiting our understanding. Here, we determined the structures of mouse pendrin with symmetric and characteristically asymmetric homodimer conformations by cryo-electron microscopy. The asymmetric homodimer consists of an inward-facing protomer and an intermediate-state protomer, representing the coincident uptake and secretion process, and exhibits the unique state of pendrin as an electroneutral exchanger. This previously unrevealed conformation, together with other conformations we captured, provides an inverted alternate-access mechanism for anion exchange. Furthermore, our structural and functional data disclosed the properties of anion exchange cleft and interpreted the important pathogenetic mutations. These investigations shed light on the pendrin exchange mechanism and extend our structure-guided understanding of pathogenetic mutations. One-Sentence Summary Cryo-EM asymmetric Pendrin homodimer cracks its exchange mechanism and guides our understanding for pathogenetic mutations.

Abstract As a central hub for metabolism, the liver exhibits strong adaptability to maintain homeostasis in response to food fluctuations throughout evolution. However, the mechanisms governing this resilience remain incompletely understood. Receptor interacting protein kinase 1 (RIPK1) plays a key role in regulating cell survival, cell death, and inflammation. Despite extensive research on its involvement in various pathological conditions, the physiological role of RIPK1 remains relatively unexplored. In this study, we identified RIPK1 in hepatocytes as a critical regulator in preserving hepatic homeostasis during metabolic challenges, such as short-term fasting or high-fat dieting. Our results demonstrated that hepatocyte-specific deficiency of RIPK1 sensitized the liver to short-term fasting-induced liver injury and hepatocyte apoptosis in both male and female mice. Despite being a common physiological stressor that typically does not induce liver inflammation, short-term fasting triggered hepatic inflammation and compensatory proliferation in hepatocyte-specific RIPK1-deficient ( Ripk1 Δhep ) mice. Transcriptomic analysis revealed that short-term fasting oriented the hepatic microenvironment into an inflammatory state in Ripk1 Δhep mice, with upregulated expression of inflammation and immune cell recruitment-associated genes. Single-cell RNA sequencing further confirmed the altered cellular composition in the liver of Ripk1 Δhep mice during fasting, highlighting the increased recruitment of macrophages to the liver. Mechanically, our results indicated that ER stress was involved in fasting-induced liver injury in Ripk1 Δhep mice. Overall, our findings revealed the role of RIPK1 in maintaining liver homeostasis during metabolic fluctuations and shed light on the intricate interplay between cell death, inflammation, and metabolism.

More than 30% of mRNAs are repressed by microRNAs (miRNAs) but most repressions are too weak to have a phenotypic consequence. The diffuse actions have been a central conundrum in understanding the functions of miRNAs. By applying the May-Wigner theory used in foodweb studies, we show that i) weak repressions cumulatively enhance the stability of gene regulatory network (GRN), and ii) broad and weak repressions confer greater stability than a few strong ones. Transcriptome data show that yeast cells, which do not have miRNAs, use strong and non-specific mRNA degradation to stabilize their GRN; in contrast, human cells use miRNAs to increase degradation more modestly and selectively. Simulations indicate that miRNA repressions should be distributed broadly to >25% of mRNAs, in agreement with observations. As predicted, extremely highly expressed genes are avoided and transcription factors are preferred by miRNAs. In conclusion, the diffuse repression by miRNAs is likely a system-level strategy for enhancing GRN stability. This stability control may be the mechanistic basis of "canalization" (i.e., developmental homeostasis within each species), sometimes hypothesized to be a main function of miRNAs.

Abstract The COVID-19 outbreak has become a global pandemic responsible for over 2,000,000 confirmed cases and over 126,000 deaths worldwide. In this study, we examined the immunogenicity of CHO-expressed recombinant SARS-CoV-2 S1-Fc fusion protein in mice, rabbits, and monkeys as a potential candidate for a COVID-19 vaccine. We demonstrate that the S1-Fc fusion protein is extremely immunogenic, as evidenced by strong antibody titers observed by day 7. Strong virus neutralizing activity was observed on day 14 in rabbits immunized with the S1-Fc fusion protein using a pseudovirus neutralization assay. Most importantly, in less than 20 days and three injections of the S1-Fc fusion protein, two monkeys developed higher virus neutralizing titers than a recovered COVID-19 patient in a live SARS-CoV-2 infection assay. Our data strongly suggests that the CHO-expressed SARS-CoV-2 S1-Fc recombinant protein could be a strong candidate for vaccine development against COVID-19. Highlights CHO-expressed S1-Fc protein is very immunogenic in various animals and can rapidly induce strong antibody production S1-Fc protein solicits strong neutralizing activities against live virus Stable CHO cell line expressing 50 mg/L of S1-Fc and a 3,000 L Bioreactor can produce 3 million doses of human COVID-19 vaccine every 10 days, making it an accessible and affordable option for worldwide vaccination

Gene-deficient mouse models are indispensable for interrogating mammalian gene functions, but the conventional models allow the study of only one or few genes per mouse line, which has been a bottleneck in functional genomics. To confront the challenge, we have combined the CRISPR-Cas and Cre-Lox systems to develop a novel type of mosaic mice termed MARC (Mosaic Animal based on gRNA and Cre) for targeting many genes per mouse but only one gene per cell. This technology employs a transgene comprising a modified U6 promoter upstream of a series of floxed gRNA genes linked together in tandem, with one gRNA expressed per cell following Cre-mediated recombination. At least 61 gRNA genes can be stably maintained in the transgene, and importantly, enables robust proof-of-principle in vivo screens, demonstrating the potential for quickly evaluating the functions of many genes in diverse tissues in a single MARC line. In theory, MARC can also be analyzed by single-cell sequencing, and should enable cost-effective derivation of conventional single-gene-KO lines via simple breeding. Our study establishes MARC as an important addition to the mouse genetics toolbox.

Forest ecosystems contribute substantially to global terrestrial primary productivity and climate regulation, but, in contrast to grasslands, experimental evidence for a positive biodiversity-productivity relationship in highly diverse forests is still lacking. Here, we provide such evidence from a large forest biodiversity experiment with a novel design in subtropical China. Productivity (stand-level tree basal area, aboveground volume and carbon and their annual increment) increased linearly with the logarithm of tree species richness. Additive partitioning showed that increasing positive complementarity effects combined with weakening negative selection effects caused a strengthening of the relationship over time. In 2-species mixed stands, complementary effects increased with functional distance and selection effects with vertical crown dissimilarity between species. Understorey shrubs reduced stand-level tree productivity, but this effect of competition was attenuated by shrub species richness, indicating that a diverse understorey may facilitate overall ecosystem functioning. Identical biodiversity-productivity relationships were found in plots of different size, suggesting that extrapolation to larger scales is possible. Our results highlight the potential of multi-species afforestation strategies to simultaneously contribute to mitigation of climate change and biodiversity restoration.

Cells of multi-cellular organisms evolve toward uni-cellularity in the form of cancer and, if humans intervene, continue to evolve in cell culture. During this process, gene dosage relationships may evolve in novel ways to cope with the new environment and may regress back to the ancestral uni-cellular state. In this context, the evolution of sex chromosomes vis-a-vis autosomes is of particular interest. Here, we report the chromosomal evolution in 620 cancer cell lines. Many of them jettisoned either Y or the inactive X; thus, free-living male and female cells converge by becoming “de-sexualized”. Surprisingly, the active X often doubled, accompanied by the addition of one haploid complement of autosomes, leading to an X:A ratio of 2:3 from the extant ratio of 1:2. Theoretical modeling of the frequency distribution of X:A karyotypes suggests that the 2:3 ratio confers a higher fitness and may reflect aspects of sex chromosome evolution.

Abstract Pathogenic mutations in the OTOF gene cause autosomal recessive hearing loss 9 (DFNB9), one of the most common forms of auditory neuropathy. There is no biological treatment for DFNB9. Here, we designed an OTOF gene therapy agent by dual AAV1 carrying human OTOF coding sequences with the expression driven by the hair cell-specific promoter Myo15 , AAV1-hOTOF. To develop a clinical application of AAV1-hOTOF gene therapy, we evaluated its efficacy and safety in animal models by pharmacodynamics, behavior, and histopathology. AAV1-hOTOF inner ear delivery significantly improved hearing in Otof −/− mice without affecting normal hearing in wild-type mice. AAV1 was predominately distributed to the cochlea although it was detected in other organs such as the central nervous system and the liver, and no obvious toxic effects of AAV1-hOTOF were observed in mice. To further evaluate the safety of Myo15 promoter-driven AAV1-transgene, AAV1-GFP was delivered into the inner ear of Macaca fascicularis via the round window membrane. AAV1-GFP transduced 60-94% of the inner hair cells along the cochlear turns. AAV1-GFP was detected in isolated organs and no significant adverse effects were detected. These results suggest that AAV1-hOTOF is well tolerated and effective in animals, providing critical support for its clinical translation.

Background: The inactivated whole-virion vaccine, CoronaVac, is one of the most widely used coronavirus disease 2019 (COVID-19) vaccines worldwide. There is a paucity of data indicating the durability of the immune response and the impact of immune imprinting induced by CoronaVac upon Omicron breakthrough infection. Methods: In this prospective cohort study, 41 recipients of triple-dose CoronaVac and 14 unvaccinated individuals were recruited. We comprehensively profiled adaptive immune parameters in both groups, including spike-specific immunoglobulin (Ig) G and IgA titers, neutralizing activity, B cells, follicular helper T (Tfh) cells, CD4+ and CD8+ T cells, and their memory subpopulations at 12 months after the third booster dose and at 4 weeks and 20 weeks after Omicron BA.5 infection. Results: Twelve months after the third CoronaVac vaccination, spike-specific antibody and cellular responses were detectable in most vaccinated individuals. BA.5 infection significantly augmented the magnitude, cross-reactivity and durability of serum neutralization activities, Fc-mediated phagocytosis, and nasal spike-specific IgA responses, memory B cells, activated Tfh cells memory CD4+ T cells, and memory CD8+ T cells for both the ancestral strain and Omicron subvariants, compared to unvaccinated individuals. Notably, the increase in BA.5-specific immunity after breakthrough infection was consistently higher than for the ancestral strain, suggesting no evidence of immune imprinting. Immune landscape analyses showed vaccinated individuals have better synchronization of multiple immune components than unvaccinated individuals upon heterologous SARS-CoV-2 infection. Conclusion: Our data provides detailed insight into the protective role of inactivated COVID-19 vaccine in shaping humoral and cellular immune responses to heterologous Omicron infection.

Hepatocyte cell death and liver inflammation have been well recognized as central characteristics of nonalcoholic steatohepatitis (NASH), however, the underlying molecular basis remains elusive. RIP1 kinase is a key regulator of apoptosis, necroptosis and inflammation, we thus hypothesized that the kinase activity of RIP1 may be involved in the pathogenesis of NASH. Wild-type (WT) C57BL/6 and RIP1 kinase-dead (Rip1K45A/K45A) mice were fed with methionine-and choline-deficient diet (MCD) or high-fat diet (HFD) to establish distinct NASH models. In both NASH models, compared to WT mice, Rip1K45A/K45A mice exhibited significantly less liver injury (serum ALT), less steatosis characterized by H&E staining, Oil Red O staining and hepatic lipid accumulation, decreased inflammation as demonstrated by F4/80 immunostaining and expression of pro-inflammatory markers, and less cell death in liver tissue. Moreover, hepatic fibrosis as characterized by Sirius Red staining, expression of α-SMA and other fibrosis markers, were significantly alleviated in Rip1K45A/K45A mice than WT controls. Furthermore, using bone marrow transplantation to create chimeric mice, we found that it is the RIP1 kinase in hematopoietic-derived macrophages contributing mostly to the disease progression in NASH. Results from in vitro studies were in agreement with the in vivo data, demonstrating that RIP1 kinase was required for inflammasome activation and cell death induced by saturated fatty acid (palmitic acid, PA) in bone marrow derived macrophages (BMDMs). At last, we also found that the phosphorylation and expression of RIP1 was obviously increased in patients with NAFLD or NASH, but not in healthy controls. In summary, our results indicate that RIP1 kinase is activated during the pathogenesis of steatohepatitis, and consequently induces inflammation and cell death in macrophages, contributing to the disease progression. Our study suggests that macrophage RIP1 kinase represents a specific and potential target for the treatment of NASH.