Abstract The Sec61 complex forms a protein-conducting channel in the endoplasmic reticulum (ER) membrane that is required for secretion of soluble proteins and production of many membrane proteins. Several natural and synthetic small molecules specifically inhibit the Sec61 channel, generating cellular effects that are potentially useful for therapeutic purposes, but their inhibitory mechanisms remain unclear. Here we present near-atomic-resolution structures of the human Sec61 channel inhibited by a comprehensive panel of structurally distinct small molecules— cotransin, decatransin, apratoxin F, ipomoeassin F, mycolactone, cyclotriazadisulfonamide (CADA) and eeyarestatin I (ESI). Remarkably, all inhibitors bind to a common lipid-exposed pocket formed by the partially open lateral gate and plug domain of the channel. Mutations conferring resistance to the inhibitors are clustered at this binding pocket. The structures indicate that Sec61 inhibitors stabilize the plug domain of Sec61 in a closed state, thereby preventing the protein-translocation pore from opening. Our study reveals molecular interactions between Sec61 and its inhibitors in atomic detail and offers the structural framework for further pharmacological studies and drug design.

Abstract Doa10 (MARCHF6 in metazoans) is a large polytopic membrane-embedded E3 ubiquitin ligase in the endoplasmic reticulum (ER) that plays an important role in quality control of cytosolic and ER proteins. Although Doa10 is highly conserved across eukaryotes, it is not understood how Doa10 recognizes its substrates. Here, we define the substrate recognition mechanism of Doa10 by structural and functional analyses on Saccharomyces cerevisiae Doa10 and its model substrates. Cryo-EM analysis shows that Doa10 has unusual architecture with a large lipid-filled central cavity, and its conserved middle domain forms an additional water-filled lateral tunnel open to the cytosol. Our biochemical data and molecular dynamics simulations suggest that the entrance of the substrate’s degron peptide into the lateral tunnel is required for efficient polyubiquitination. The N- and C-terminal membrane domains of Doa10 seem to form fence-like features to restrict polyubiquitination to those proteins that can access the central cavity and lateral tunnel. Our study reveals how extended hydrophobic sequences at the termini of substrate proteins are recognized by Doa10 as a signal for quality control.

Doa10 (MARCH6 in metazoans) is a large polytopic membrane-embedded E3 ubiquitin ligase in the endoplasmic reticulum (ER) that plays an important role in quality control of cytosolic and ER proteins. Although Doa10 is highly conserved across eukaryotes, it is not understood how Doa10 recognizes its substrates. Here, we defined the substrate recognition mechanism of Doa10 by structural and functional analyses on Saccharomyces cerevisiae Doa10 and its well-defined degron Deg1. Cryo-EM analysis shows that Doa10 has unusual architecture with a large lipid-filled central cavity, and its conserved middle domain forms an additional water-filled lateral tunnel open to the cytosol. Our biochemical data and molecular dynamics simulations suggest that the entrance of the substrate's degron peptide into the lateral tunnel is required for efficient polyubiquitination. The N- and C-terminal membrane domains of Doa10 seem to form fence-like features to restrict polyubiquitination to those proteins that can access the central cavity and lateral tunnel.

Autophagy involves rapid growth of phagophores through membrane addition. Newly added membranes are derived from other organelles through vesicles carrying the Atg9 protein. Membrane is delivered by fusing these vesicles with the phagophores. Atg9 is, nevertheless, not incorporated in autophagosomes. We now show that this protein is retrieved from phagophores by fission utilizing Dynamin-2 (Dnm2) as the membrane scission protein. Blocking Atg9 recycling by interfering with Dnm2 helps retain Atg9 in autophagosomes and degrades this protein by autophagy. Dnm2 colocalizes with the BAR domain protein Endophilin-B1 (EndoB1/Bif-1) when autophagy is induced, consistent with transient interactions during Atg9 retrieval. EndoB1 and Dnm2 also control the downstream fusion of phagophores to late endosomes, thus ensuring the completion of phagophores before proceeding to the next stage in the autophagy process. These data provide novel insights into the roles of membrane scission proteins during autophagy.

Mfn2 is a mitochondrial outer membrane fusion protein with the additional role of tethering mitochondria to the ER. Here, we describe a novel connection between Mfn2 and calcium release from mitochondria. We show that Mfn2 controls the mitochondrial inner membrane sodium-calcium exchange protein NCLX, which is a major source for calcium release from mitochondria. This discovery was made with the fungal toxin Phomoxanthone (PXA), which induces calcium release from mitochondria. PXA-induced calcium release is blocked by a chemical inhibitor of NCLX, while NCLX and Mfn2 deletions both also prevent PXA-induced calcium release. CETSA experiments show that PXA directly targets Mfn2, which likely controls NCLX through physical interactions since co-immunoprecipitation and proximity ligation assays show increased association between Mfn2 and NCLX upon treatment with PXA. Interactions between Mfn2 and NCLX also increase when cells are treated with mitochondrial ROS-inducing conditions, such as oligomycin treatment of respiring cells, while the interactions do not increase in Oma1 -/- cells. It seems likely that opening of cristae by Oma1-mediated cleavage of Opa1 promotes translocation of NCLX from cristae to the rim where it can come into contact with Mfn2 thus promoting PXA-induced calcium release from mitochondria. These results therefore delineate a pathway that connects ROS produced inside mitochondria with calcium release and signaling in the cytosol.

Summary The universally conserved Sec61/SecY channel mediates transport of many newly synthesized polypeptides across membranes, an essential step in protein secretion and membrane protein integration 1-5 . The channel has two gating mechanisms—a lipid-facing lateral gate, through which hydrophobic signal sequences or transmembrane helices (TMs) are released into the membrane, and a vertical gate, called the plug, which regulates the water-filled pore required for translocation of hydrophilic polypeptide segments 6 . Currently, how these gates are controlled and how they regulate the translocation process remain poorly understood. Here, by analyzing cryo-electron microscopy (cryo-EM) structures of several variants of the eukaryotic post-translational translocation complex Sec61-Sec62-Sec63, we reveal discrete gating steps of Sec61 and the mechanism by which Sec62 and Sec63 induce these gating events. We show that Sec62 forms a V-shaped structure in front of the lateral gate to fully open both gates of Sec61. Without Sec62, the lateral gate opening narrows, and the vertical pore becomes closed by the plug, rendering the channel inactive. We further show that the lateral gate is opened first by interactions between Sec61 and Sec63 in both cytosolic and luminal domains, a simultaneous disruption of which fully closes the channel. Our study defines the function of Sec62 and illuminates how Sec63 and Sec62 work together in a hierarchical manner to activate the Sec61 channel for post-translational translocation.