The role of genomic variants in disease, including cancer, continues to expand thanks to the advent of advanced sequencing techniques integrated into clinical practice. The rapid growth in the identification of genomic variants has led to the classification of many variants as Variants of Uncertain Significance (VUS) or with conflicting evidence, posing challenges in their interpretation and application. Here we introduce MAVISp ( M ulti-layered A ssessment of V arIants by S tructure for p roteins), a modular structural framework for variant interpretation. We also provide a web server ( https://services.healthtech.dtu.dk/services/MAVISp-1.0/ ), to enhance data accessibility, consultation, and re-usability. Currently, MAVISp offers analyses for more than 200 different proteins, encompassing approximately 85000 variants. A dedicated team of biocurators and reviewers continuously analyze and update protein targets using standardized workflows, incorporating high-throughput free energy calculations or biomolecular simulations. Here, we illustrate the potential of the MAVISp approach through a selection of case studies. Our framework aids in the interpretation of genomic variants, particularly those categorized as VUS, and holds great potential for advancing the understanding and application of genomics in disease research.

Abstract Methods to reconstruct the mitochondrial DNA (mtDNA) sequence using short-read sequencing come with an inherent bias due to amplification and mapping. They can fail to determine the phase of variants, to capture multiple deletions and to cover the mitochondrial genome evenly. Long-read whole genome sequencing is prohibitively expensive for mtDNA heteroplasmy detection and often does not recapitulate the full mtDNA length. Here we describe a method to target, multiplex and sequence full-length, native single-molecule the human mitochondrial genome utilizing the RNA-guided DNA endonuclease Cas9. Combining Cas9 induced breaks as barcodes with long-read sequencing, we implemented a protocol in an optimal setting for both high or low integrity genomic DNA to target the circular mitochondrial genome with extremely high coverage. Our analytical pipeline efficiently detects single nucleotide heteroplasmy, physically determines phase and can accurately disentangle complex deletion patterns. This workflow is a unique tool for studying mtDNA variation in health and disease, and will accelerate mitochondrial research.

Abstract Liquid biopsy testing utilising Next Generation Sequencing (NGS) is rapidly moving towards clinical adoption for personalised oncology. However, before NGS can fulfil its potential any novel testing approach must identify ways of reducing errors, allowing for separating true low-frequency mutations from procedural artefacts, and be designed to improve upon current technologies while also avoiding their limitations. Popular NGS technologies typically utilise two approaches; PCR and ligation, which have known limitations and seem to have reached a development plateau with only small, stepwise improvements being made. To maximise the ultimate utility of liquid biopsy testing we have developed a highly versatile approach to NGS: Adaptor Template Oligo Mediated Sequencing (ATOM-Seq). ATOM-Seq’s strengths and versatility avoid the major limitations of both PCR- and ligation-based approaches. This technology is ligation free, simple, efficient, flexible, and streamlined, and offers novel advantages that make it perfectly suited for use on highly challenging clinical material. Using reference materials, we demonstrate detection of known SNVs at allele frequencies of 0.1% using as little as 20 ng of DNA, as well as the ability to detect fusions from RNA. We illustrate ATOM-Seq’s suitability for clinical testing by showing high concordance rates between paired cfDNA and FFPE clinical samples.