The generation of high-titer, helper-free retroviruses by transient transfection has been achieved by using the highly transfectable 293T cell line into which are stably introduced constructs that express retroviral packaging functions. The resulting ecotropic virus packaging cell line BOSC 23 produces infectious retrovirus at > 10(6) infectious units/ml of supernatant within 72 hr after CaPO4-mediated transfection. A stringent assay for replication-competent virus showed that no helper virus was present. The system can produce high titers of retroviral vectors expressing genes that are extremely difficult to propagate at high titer in stable producer lines. This method should facilitate and extend the use of helper-free retroviral gene transfer, as well as be useful for gene therapy.

Simultaneous measurement of more than 30 properties in individual human cells is used to characterize signaling in the immune system.

Summary

 Acute myeloid leukemia (AML) manifests as phenotypically and functionally diverse cells, often within the same patient. Intratumor phenotypic and functional heterogeneity have been linked primarily by physical sorting experiments, which assume that functionally distinct subpopulations can be prospectively isolated by surface phenotypes. This assumption has proven problematic, and we therefore developed a data-driven approach. Using mass cytometry, we profiled surface and intracellular signaling proteins simultaneously in millions of healthy and leukemic cells. We developed PhenoGraph, which algorithmically defines phenotypes in high-dimensional single-cell data. PhenoGraph revealed that the surface phenotypes of leukemic blasts do not necessarily reflect their intracellular state. Using hematopoietic progenitors, we defined a signaling-based measure of cellular phenotype, which led to isolation of a gene expression signature that was predictive of survival in independent cohorts. This study presents new methods for large-scale analysis of single-cell heterogeneity and demonstrates their utility, yielding insights into AML pathophysiology.

Machine learning was applied for the automated derivation of causal influences in cellular signaling networks. This derivation relied on the simultaneous measurement of multiple phosphorylated protein and phospholipid components in thousands of individual primary human immune system cells. Perturbing these cells with molecular interventions drove the ordering of connections between pathway components, wherein Bayesian network computational methods automatically elucidated most of the traditionally reported signaling relationships and predicted novel interpathway network causalities, which we verified experimentally. Reconstruction of network models from physiologically relevant primary single cells might be applied to understanding native-state tissue signaling biology, complex drug actions, and dysfunctional signaling in diseased cells.

The recent advent of methods for high-throughput single-cell molecular profiling has catalyzed a growing sense in the scientific community that the time is ripe to complete the 150-year-old effort to identify all cell types in the human body. The Human Cell Atlas Project is an international collaborative effort that aims to define all human cell types in terms of distinctive molecular profiles (such as gene expression profiles) and to connect this information with classical cellular descriptions (such as location and morphology). An open comprehensive reference map of the molecular state of cells in healthy human tissues would propel the systematic study of physiological states, developmental trajectories, regulatory circuitry and interactions of cells, and also provide a framework for understanding cellular dysregulation in human disease. Here we describe the idea, its potential utility, early proofs-of-concept, and some design considerations for the Human Cell Atlas, including a commitment to open data, code, and community.

Summary

 A highly multiplexed cytometric imaging approach, termed co-detection by indexing (CODEX), is used here to create multiplexed datasets of normal and lupus (MRL/lpr) murine spleens. CODEX iteratively visualizes antibody binding events using DNA barcodes, fluorescent dNTP analogs, and an in situ polymerization-based indexing procedure. An algorithmic pipeline for single-cell antigen quantification in tightly packed tissues was developed and used to overlay well-known morphological features with de novo characterization of lymphoid tissue architecture at a single-cell and cellular neighborhood levels. We observed an unexpected, profound impact of the cellular neighborhood on the expression of protein receptors on immune cells. By comparing normal murine spleen to spleens from animals with systemic autoimmune disease (MRL/lpr), extensive and previously uncharacterized splenic cell-interaction dynamics in the healthy versus diseased state was observed. The fidelity of multiplexed spatial cytometry demonstrated here allows for quantitative systemic characterization of tissue architecture in normal and clinically aberrant samples.

Transcriptome mapping in the 3D brain RNA sequencing samples the entire transcriptome but lacks anatomical information. In situ hybridization, on the other hand, can only profile a small number of transcripts. In situ sequencing technologies address these shortcomings but face a challenge in dense, complex tissue environments. Wang et al. combined an efficient sequencing approach with hydrogel-tissue chemistry to develop a multidisciplinary technology for three-dimensional (3D) intact-tissue RNA sequencing (see the Perspective by Knöpfel). More than 1000 genes were simultaneously mapped in sections of mouse brain at single-cell resolution to define cell types and circuit states and to reveal cell organization principles. Science , this issue p. eaat5691 ; see also p. 328

The work of Michael Angelo and colleagues uses multiplexed ion beam imaging (MIBI) to localize and visualize protein expression in a manner analogous to immunohistochemistry (IHC) while circumventing some of the limitations of conventional IHC with clinical samples. MIBI uses secondary ion mass spectrometry to image antibodies tagged with isotopically pure elemental metal reporters, expanding the number of targets that can be analyzed simultaneously to about 100. The approach, used here to image breast tumor tissue sections, offers over a five-log dynamic range and compatibility with standard formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Immunohistochemistry (IHC) is a tool for visualizing protein expression that is employed as part of the diagnostic workup for the majority of solid tissue malignancies. Existing IHC methods use antibodies tagged with fluorophores or enzyme reporters that generate colored pigments. Because these reporters exhibit spectral and spatial overlap when used simultaneously, multiplexed IHC is not routinely used in clinical settings. We have developed a method that uses secondary ion mass spectrometry to image antibodies tagged with isotopically pure elemental metal reporters. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) is capable of analyzing up to 100 targets simultaneously over a five-log dynamic range. Here, we used MIBI to analyze formalin-fixed, paraffin-embedded human breast tumor tissue sections stained with ten labels simultaneously. The resulting data suggest that MIBI can provide new insights into disease pathogenesis that will be valuable for basic research, drug discovery and clinical diagnostics.

The ability to analyze multiple single-cell parameters is critical for understanding cellular heterogeneity. Despite recent advances in measurement technology, methods for analyzing high-dimensional single-cell data are often subjective, labor intensive and require prior knowledge of the biological system. To objectively uncover cellular heterogeneity from single-cell measurements, we present a versatile computational approach, spanning-tree progression analysis of density-normalized events (SPADE). We applied SPADE to flow cytometry data of mouse bone marrow and to mass cytometry data of human bone marrow. In both cases, SPADE organized cells in a hierarchy of related phenotypes that partially recapitulated well-described patterns of hematopoiesis. We demonstrate that SPADE is robust to measurement noise and to the choice of cellular markers. SPADE facilitates the analysis of cellular heterogeneity, the identification of cell types and comparison of functional markers in response to perturbations.

A pathway for the production of aromatic amino acid metabolites in Clostridium sporogenes is described; modulation of serum levels of these metabolites in gnotobiotic mice affects intestinal permeability and systemic immunity. The human microbiome has a substantial effect on our health. Our gut microbes produce a range of small molecules, many of which can reach relevant concentrations, yet we know surprisingly little about microbial metabolic pathways and how they affect the host. Here, Justin Sonnenburg, Michael Fischbach and colleagues use genetics and metabolic profiling to identify the gene cluster of Clostridium sporogenes that metabolizes aromatic amino acids, several of the products of which are produced exclusively by the microbiota. For example, the neuroprotective agent indolepropionic acid (IPA) was also produced by several other gut bacteria. In mice with controlled bacterial colonies, the serum levels of IPA and host physiology can be modulated by genetic modification of C. sporogenes. The human gut microbiota produces dozens of metabolites that accumulate in the bloodstream1,2, where they can have systemic effects on the host. Although these small molecules commonly reach concentrations similar to those achieved by pharmaceutical agents, remarkably little is known about the microbial metabolic pathways that produce them. Here we use a combination of genetics and metabolic profiling to characterize a pathway from the gut symbiont Clostridium sporogenes that generates aromatic amino acid metabolites. Our results reveal that this pathway produces twelve compounds, nine of which are known to accumulate in host serum. All three aromatic amino acids (tryptophan, phenylalanine and tyrosine) serve as substrates for the pathway, and it involves branching and alternative reductases for specific intermediates. By genetically manipulating C. sporogenes, we modulate serum levels of these metabolites in gnotobiotic mice, and show that in turn this affects intestinal permeability and systemic immunity. This work has the potential to provide the basis of a systematic effort to engineer the molecular output of the gut bacterial community.