Abstract

 Eukaryotic cells can detect shallow gradients of chemoattractants with exquisite precision and respond quickly to changes in the gradient steepness and direction. Here, we describe a set of models explaining both adaptation to uniform increases in chemoattractant and persistent signaling in response to gradients. We demonstrate that one of these models can be mapped directly onto the biochemical signal-transduction pathways underlying gradient sensing in amoebae and neutrophils. According to this scheme, a locally acting activator (PI3-kinase) and a globally acting inactivator (PTEN or a similar phosphatase) are coordinately controlled by the G-protein activation. This signaling system adapts perfectly to spatially homogeneous changes in the chemoattractant. In chemoattractant gradients, an imbalance between the action of the activator and the inactivator results in a spatially oriented persistent signaling, amplified by a substrate supply-based positive feedback acting through small G-proteins. The amplification is activated only in a continuous presence of the external signal gradient, thus providing the mechanism for sensitivity to gradient alterations. Finally, based on this mapping, we make predictions concerning the dynamics of signaling. We propose that the underlying principles of perfect adaptation and substrate supply-based positive feedback will be found in the sensory systems of other chemotactic cell types.

Biological networks, such as those describing gene regulation, signal transduction, and neural synapses, are representations of large-scale dynamic systems. Discovery of organizing principles of biological networks can be enhanced by embracing the notion that there is a deep interplay between network structure and system dynamics. Recently, many structural characteristics of these non-random networks have been identified, but dynamical implications of the features have not been explored comprehensively. We demonstrate by exhaustive computational analysis that a dynamical property—stability or robustness to small perturbations—is highly correlated with the relative abundance of small subnetworks (network motifs) in several previously determined biological networks. We propose that robust dynamical stability is an influential property that can determine the non-random structure of biological networks.

Cells have an internal compass that enables them to move along shallow chemical gradients. As amoeboid cells migrate, signaling events such as Ras and PI3K activation occur spontaneously on pseudopodia. Uniform stimuli trigger a symmetric response, whereupon cells stop and round up; then localized patches of activity appear as cells spread. Finally cells adapt and resume random migration. In contrast, chemotactic gradients continuously direct signaling events to the front of the cell. Local-excitation, global-inhibition (LEGI) and reaction–diffusion models have captured some of these features of chemotaxing cells, but no system has explained the complex response kinetics, sensitivity to shallow gradients, or the role of recently observed propagating waves within the actin cytoskeleton. We report here that Ras and PI3K activation move in phase with the cytoskeleton events and, drawing on all of these observations, propose the LEGI-biased excitable network hypothesis. We formulate a model that simulates most of the behaviors of chemotactic cells: In the absence of stimulation, there are spontaneous spots of activity. Stimulus increments trigger an initial burst of patches followed by localized secondary events. After a few minutes, the system adapts, again displaying random activity. In gradients, the activity patches are directed continuously and selectively toward the chemoattractant, providing an extraordinary degree of amplification. Importantly, by perturbing model parameters, we generate distinct behaviors consistent with known classes of mutants. Our study brings together heretofore diverse observations on spontaneous cytoskeletal activity, signaling responses to temporal stimuli, and spatial gradient sensing into a unified scheme.

The plasma membrane is widely regarded as the hub of the signal transduction network activities that drives numerous physiological responses, including cell polarity and migration. Yet, the symmetry breaking process in the membrane, that leads to dynamic compartmentalization of different proteins, remains poorly understood. Using multimodal live-cell imaging, here we first show that multiple endogenous and synthetic lipid-anchored proteins, despite maintaining stable tight association with the inner leaflet of the plasma membrane, were unexpectedly depleted from the membrane domains where the signaling network was spontaneously activated such as in the new protrusions as well as within the propagating ventral waves. Although their asymmetric patterns resembled those of standard peripheral "back" proteins such as PTEN, unlike the latter, these lipidated proteins did not dissociate from the membrane upon global receptor activation. Our experiments not only discounted the possibility of recurrent reversible translocation from membrane to cytosol as it occurs for weakly bound peripheral membrane proteins, but also ruled out the necessity of directed vesicular trafficking and cytoskeletal supramolecular structure-based restrictions in driving these dynamic symmetry breaking events. Selective photoconversion-based protein tracking assays suggested that these asymmetric patterns instead originate from the inherent ability of these membrane proteins to "dynamically partition" into distinct domains within the plane of the membrane. Consistently, single-molecule measurements showed that these lipid-anchored molecules have substantially dissimilar diffusion profiles in different regions of the membrane. When these profiles were incorporated into an excitable network-based stochastic reaction-diffusion model of the system, simulations revealed that our proposed "dynamic partitioning" mechanism is sufficient to give rise to familiar asymmetric propagating wave patterns. Moreover, we demonstrated that normally uniform integral and lipid-anchored membrane proteins in Dictyostelium and mammalian neutrophil cells can be induced to partition spatiotemporally to form polarized patterns, by optogenetically recruiting membrane domain-specific peptides to these proteins. Together, our results indicate "dynamic partitioning" as a new mechanism of plasma membrane organization, that can account for large-scale compartmentalization of a wide array of lipid-anchored and integral membrane proteins in different physiological processes.

Abstract Chemotaxis, the directional motility of cells in response to spatial gradients of chemical cues, is a fundamental process behind a wide range of biological events, including the innate immune response and cancer metastasis. Recent advances in cell biology have shown that the protrusions that enable amoeboid cells to move are driven by the stochastic threshold crossings of an underlying excitable system. As a cell encounters a chemoattractant gradient, the size of this threshold is regulated spatially so that the crossings are biased towards the front of the cell. For efficient directional migration, cells must limit undesirable lateral and rear-directed protrusions. The inclusion of a control mechanism to suppress these unwanted firings would enhance chemotactic efficiency. It is known that absolute concentration robustness (ACR) exerts tight control over the mean and variance of species concentration. Here, we demonstrate how the coupling of the ACR mechanism to the cellular signaling machinery reduces the likelihood of threshold crossings in the excitable system. Moreover, we show that using the cell’s innate gradient sensing apparatus to direct the action of ACR to the rear, suppresses the lateral movement of the cells and that this results in improved chemotactic performance.

Abstract Studies in the model systems, Dictyostelium amoebae and HL-60 neutrophils, have shown that local Ras activity directly regulates cell motility or polarity. Localized Ras activation on the membrane is spatiotemporally regulated by its activators, RasGEFs, and inhibitors, RasGAPs, which might be expected to create a stable ‘front’ and ‘back’, respectively, in migrating cells. Focusing on C2GAPB in amoebae and RASAL3 in neutrophils, we investigated how Ras activity along the cortex controls polarity. Since existing gene knockout and overexpression studies can be circumvented, we chose optogenetic approaches to assess the immediate, local effects of these Ras regulators on the cell cortex. In both cellular systems, optically targeting the respective RasGAPs to the cell front extinguished existing protrusions and changed the direction of migration, as might be expected. However, when the expression of C2GAPB was induced globally, amoebae polarized within hours. Furthermore, within minutes of globally recruiting either C2GAPB in amoebae or RASAL3 in neutrophils, each cell type polarized and moved more rapidly. Targeting the RasGAPs to the cell backs exaggerated these effects on migration and polarity. Overall, in both cell types, RasGAP-mediated polarization was brought about by increased actomyosin contractility at the back and sustained, localized F-actin polymerization at the front. These experimental results were accurately captured by computational simulations in which Ras levels control front and back feedback loops. The discovery that context-dependent Ras activity on the cell cortex has counterintuitive, unanticipated effects on cell polarity can have important implications for future drug-design strategies targeting oncogenic Ras.

Abstract Fluorescent biosensors allow for real-time monitoring of biochemical activities in cells, but their multiplexing capacity is severely limited by the availability of spectral space. We overcome this problem by developing a set of barcoding proteins that are spectrally separable from commonly used FRET (fluorescence resonance energy transfer)-based and single-fluorophore biosensors. Mixed populations of barcoded cells expressing different biosensors can be concurrently imaged and computationally unmixed to achieve highly multiplexed tracking of biochemical activities in live cells.