Significance Recent studies indicate that greenhouse gas emission inventories are likely missing methane emission sources. We conducted the first methane emission measurements from abandoned oil and gas wells and found substantial emissions, particularly from high-emitting abandoned wells. These emissions are not currently considered in any emissions inventory. We scaled methane emissions from our direct measurements of abandoned wells in Pennsylvania and calculate that they represent 4–7% of current total anthropogenic methane emissions in Pennsylvania. Millions of abandoned wells exist across the country and some are likely to be high emitters. Additional measurements of methane emissions from abandoned wells and their inclusion in greenhouse gas inventories will aid in developing and implementing appropriate greenhouse gas emission reduction strategies.

Abstract The enhanced biological phosphorus removal (EBPR) has been widely applied in treating domestic wastewater, while the performance on high-strength P wastewater is less investigated and the feasibility of coupling with short-cut nitrogen removal process remains unknown. This study first achieved the simultaneous high-efficient P removal and stable nitrite accumulation in one sequencing batch reactor for treating the synthetic digested manure wastewater. The average effluent P could be down to 0.8 ± 1.0 mg P/L and the P removal efficiency was 99.5 ± 0.8%. Candidatus Accumulibacter was the dominant polyphosphate accumulating organism (PAO) with the relative abundance of 14.2-33.1% in the reactor. Examination of the micro-diversity of Candidatus Accumulibacter using 16s rRNA gene-based oligotyping analysis revealed one unique Accumulibacter oligotype that different from the conventional system, which accounted for 64.2-87.9% of the total Accumulibacter abundance. The presence of high-abundant glycogen accumulating organisms (GAO) (15.6-40.3%, Defluviicoccus and Candidatus Competibacter) did not deteriorate the EBPR performance. Moreover, nitrite accumulation happened in the system with the effluent nitrite up to 20.4 ± 6.4 mg N/L and the nitrite accumulation ratio was nearly 100% maintained for 140 days (420 cycles). Nitrosomonas was the dominant ammonia-oxidizing bacteria with relative abundance of 0.3-2.4% while nitrite-oxidizing bacteria were almost undetected (<0.1%). The introduction of extended anaerobic phase and high volatile fatty acid concentrations were proposed to be the potential selector forces to promote partial nitrification. This is the first study that combined EBPR with nitrite-accumulation for digested manure wastewater treatment, and it provided new sights in strategies to combine the EBPR and short-cut nitrogen removal via nitrite to achieve simultaneous nitrogen and phosphorus removal.

Abstract The global demand for critical rare earth elements (REE) is rising 1 with the increase in demand for sustainable energy technologies like wind turbines 2,3 , electric vehicles 2,3 , and high efficiency lighting 4 . Current processes for producing REE require high energy inputs and can produce disproportionate amounts of hazardous waste. Biological methods for REE production are a promising solution to this problem. In earlier work we identified the most important genetic mechanisms contributing to the REE-bioleaching capability of Gluconobacter oxydans B58 5 . Here we have targeted two of these mechanisms to generate a high-efficiency bio-mining strain of G. oxydans . Disruption of the phosphate-specific transport system through a clean deletion of pstS constitutively turns on the phosphate starvation response, yielding a much more acidic biolixiviant, and increasing bioleaching by up to 30%. Coupling knockout of pstS with the over-expression of the mgdh membrane-bound glucose dehydrogenase gene, results in up to 73% improvement of REE-bioleaching.

The growing resistance of weeds to herbicides demands innovative strategies that harness soil biology for effective weed control. We examined the use of carbon amendments to stimulate microbial immobilization of soil nitrogen for weed control. We hypothesized that increased carbon availability will stimulate soil microbial growth, leading to greater nitrogen immobilization, which consequently decreases plant-available nitrogen and suppresses the growth of nitrogen-responsive weed species. We buried 80 19-L pots in a research farm field and added sawdust and sucrose to soils as a high carbon treatment and used unamended soils as a control. We examined eight different weed species separately, and measured plant growth, soil carbon, available nitrate, microbial carbon and nitrogen, and microbial community composition after 11 weeks of treatment. The carbon amendments altered plant-microbial competition for nitrogen, resulting in reduced biomass for most weed species. The carbon-amended soils had higher microbial biomass carbon and nitrogen, slower nitrogen cycling, and less available soil nitrogen, indicating enhanced nitrogen immobilization. The carbon treatment altered the beta diversity of soil fungi and bacteria and reduced fungal alpha diversity estimated by the Shannon index. The study results indicate that high carbon substrates can be used to modify plant-microbial competition for soil nitrogen with important implications for developing sustainable weed management practices.

Abstract Rare earth elements (REE) are critical components of our technological society and essential for renewable energy technologies. Traditional thermochemical processes to extract REE from mineral ores or recycled materials are costly and environmentally harmful 1 , and thus more sustainable extraction methods require exploration. Bioleaching offers a promising alternative to conventional REE extraction 2–4 , and is already used to extract 5% of the world’s gold, and ≈ 15% of the world’s copper supply 5,6 . However, the performance of REE bioleaching lags far behind thermochemical processes 2,7–9 . Despite this, to the best of our knowledge no genetic engineering strategies have yet been used to enhance REE bioleaching, and little is known of the genetics that confer this capability. Here we build a whole genome knockout collection for Gluconobacter oxydans B58, one of the most promising organisms for REE bioleaching 10 , and use it to comprehensively characterize the genomics of REE bioleaching. In total, we find 304 genes that notably alter production of G. oxydans’ acidic biolixiviant, including 165 that hold up under statistical comparison with wild-type. The two most impactful groups of genes involved in REE bioleaching have opposing influences on acid production and REE bioleaching. Disruption of genes underlying synthesis of the cofactor pyrroloquinoline quinone (PQQ) and the PQQ-dependent membrane-bound glucose dehydrogenase all but eliminates bioleaching. In contrast, disruption of the phosphate-specific transport system accelerates acid production and enhances bioleaching. We identified 6 disruption mutants, that increase bioleaching by at least 11%. Most significantly, disruption of pstC , encoding part of the phosphate-specific transporter, pstSCAB , enhances bioleaching by 18%. Taken together, these results give a comprehensive roadmap for engineering multiple sites in the genome of G. oxydans to further increase its bioleaching efficiency.

Abstract Rare earth elements (REE) are essential ingredients of sustainable energy technologies, but separation of individual REE is one of the hardest problems in chemistry today 1 . Biosorption, where molecules adsorb to the surface of biological materials, offers a sustainable alternative to environmentally harmful solvent extractions currently used for separation of rare earth elements (REE). The REE-biosorption capability of some microorganisms allows for REE separations that, under specialized conditions, are already competitive with solvent extractions 2 , suggesting that genetic engineering could allow it to leapfrog existing technologies. To identify targets for genomic improvement we screened 3,373 mutants from the whole genome knockout collection of the known REE-biosorbing microorganism Shewanella oneidensis MR-1 3,4 . We found 130 genes that increased biosorption of the middle REE europium, and 112 that reduced it. We verified biosorption changes from the screen for a mixed solution of three REE (La, Eu, Yb) using Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) in solution conditions with a range of ionic strengths and REE concentrations. We found, among other things, that disruptions of a key regulatory component of the arc system ( hptA ), which regulates cellular response to anoxic environments and polysaccharide biosynthesis related genes ( wbpQ, wbnJ, SO_3183 ) consistently increase biosorption across all our solution conditions. Our largest total biosorption change comes from our SO_4685 —a capsular polysaccharide (CPS) synthesis gene—disruption which results in an up to 79% increase in biosorption and nusA —a regulatory protein—disruption which results in an up to 35% decrease in biosorption. Knockouts of glnA, pyrD , and SO_3183 increase relative biosorption affinity for ytterbium over lanthanum in multiple solution conditions tested, while many other genes we explored have more complex binding affinity changes. Taken together, these results begin to elucidate how various genes affect the membrane chemistry of S. oneidensis and offer potential targets for improving biosorption and separation of REE.

Class A biosolids from water resource recovery facilities (WRRFs) are increasingly used as sustainable alternatives to synthetic fertilizers. However, the high phosphorus to nitrogen ratio in biosolids leads to a potential accumulation of phosphorus after repeated land applications. Extracting vivianite, an FeP mineral, prior to the final dewatering step in the biosolids treatment can reduce the P content in the resulting class A biosolids and achieve a P:N ratio closer to the 1:2 of synthetic fertilizers. Using ICP-MS, IC, UV–Vis colorimetric methods, Mössbauer spectroscopy, and SEM-EDX, a full-scale characterization of vivianite at the Blue Plains Advanced Wastewater Treatment Plant (AWTTP) was surveyed throughout the biosolids treatment train. Results showed that the vivianite-bound phosphorus in primary sludge thickening, before pre-dewatering, after thermal hydrolysis, and after anaerobic digestion corresponded to 8 %, 52 %, 40 %, and 49 % of the total phosphorus in the treatment influent. Similarly, the vivianite-bound iron concentration also corresponded to 8 %, 52 %, 40 %, and 49 % of the total iron present (from FeCl3 dosing), because the total molar ratio between total iron and total incoming phosphorus was 1.5:1, which is the same stoichiometry of vivianite. Based on current P:N levels in the Class A biosolids at Blue Plains, a vivianite recovery target of 40 % to ideally 70 % is required in locations with high vivianite content to reach a P:N ratio in the resulting class A biosolid that matches synthetic fertilizers of 1:1.3 to 1:2, respectively. A financial analysis on recycling iron from the recovered vivianite had estimated that 14–25 % of Blue Plain's annual FeCl3 demand can potentially be met. Additionally, model simulations with Visual Minteq were used to evaluate the pre-treatment options that maximize vivianite recovery at different solids treatment train locations.

Concurrent biological phosphorus (P) recovery and nitrogen (N) removal in treating high-strength wastewater (such as anaerobic digestate) has been considered incompatible due to presumed conflicts in the conflicting optimum conditions required by phosphorous accumulating organisms (PAO) and nitrifiers. However, this study achieved a stable nitrite accumulation while still maintained PAO activities in one sequencing batch reactor for treating the manure digestate under two aeration schemes (continuous versus intermittent aeration). Nitrite accumulated up to 80.5 ± 21.1 mg-N/L under continuous aeration (6 h) mode. Switching to intermittent aeration (equivalent to 3 h) halved nitrite accumulation but increased total nitrogen removal efficiency from 53.5 ± 12.2% to 84.7 ± 9.4%. Mass balance analysis indicates that nearly all ammonia was removed as N2O. Both Enhanced Biological Phosphorus Removal (EBPR) activity assessment and phenotypic trait detection via single cell Raman spectrum (SCRS) confirmed the existence of yet to be identified PAOs that are resistant to high nitrite inhibition in our system. Visual Minteq calculation indicates that high concentrations of Ca in manure digestate may form precipitates and influence the bioavailability of P forms. Therefore, both biotic and abiotic pathways lead to a total P removal rate of around 61.0 ± 6.8%. This study highlights new opportunities to combine short-cut nitrogen removal via partial nitrification, nitrous oxide (N2O) collection, and EBPR in commercial farm-collected digested manure wastewater. Higher N and P removal efficiency could potentially be achieved by tuning aeration schemes in combination with down-stream anammox process.

Abstract The transition to a sustainable energy economy will require an enormous increase in the supply of rare earth elements (REE). Bioleaching offers a promising alternative to conventional hydrometallurgical methods for REE extraction from low-grade ores. However, exploiting this potential remains challenging due to large gaps in our understanding of the genetics involved, and inadequate biological tools to address them. We generated a highly non-redundant whole genome knockout collection for the bioleaching microbe Gluconobacter oxydans B58, reducing redundancy by 85% compared to the previous best collection. This new collection was directly screened for bioleaching neodymium from a synthetic monazite powder, identifying 89 genes important for bioleaching, 68 of which have not previously been associated with this mechanism. We conducted bench-scale experiments to validate the extraction efficiency of promising strains: 8 demonstrated significant increases in bioleaching by up to 111% ( G. oxydans δ GO_1598 , a disruption of the gene encoding the orotate phosphoribosyltransferase enzyme PyrE), and one strain significantly reduced it by 97% (δ GO_1096 , a disruption of the gene encoding the GTP-binding protein TypA). Notable changes in biolixiviant pH were only observed for 3 strains, suggesting an important role for non-acid mechanisms in bioleaching. These findings provide valuable insights into further enhancing REE-bioleaching by G. oxydans ’ through targeted genetic engineering.

Abstract Soil microbiomes harbor unparalleled functional and phylogenetic diversity and are sources of novel metabolisms. However, extracting isolates with a targeted function from complex microbiomes is not straightforward, particularly if the associated phenotype does not lend itself to high-throughput screening. Here, we tackle the methylation of arsenic (As) in anoxic soils. By analogy to mercury, As methylation was proposed to be catalyzed by sulfate-reducing bacteria. However, to date, there are no anaerobic isolates capable of As methylation, whether sulfate-reducing or otherwise. The isolation of such a microorganism has been thwarted by the fact that the anaerobic bacteria harboring a functional arsenite S-adenosylmethionine methyltransferase (ArsM) tested to date did not methylate As in pure culture. Additionally, fortuitous As methylation can result from the release of non-specific methyltransferases upon lysis. Thus, we combined metagenomics, metatranscriptomics, and metaproteomics to identify the microorganisms actively methylating As in anoxic soil-derived microbial cultures. Based on the metagenome-assembled genomes of microorganisms expressing ArsM, we isolated Paraclostridium sp. strain EML, which was confirmed to actively methylate As anaerobically. This work is an example of the application of meta-omics to the isolation of elusive microorganisms.