ABSTRACT Mutations in, or deficiency of, FMRP is responsible for the Fragile X syndrome (FXS), the most common cause for inherited intellectual disability. FMRP is a nucleocytoplasmic protein, primarily characterized as a translation repressor with poorly understood nuclear function(s). We recently uncovered a genome protective role of FMRP. We reported that FXS patient-derived cells lacking FMRP sustain higher level of DNA double-strand breaks than normal cells, a phenotype further exacerbated by DNA replication stress. The stress-induced DSBs occur at sequences prone to form R-loops, which are co-transcriptional RNA:DNA hybrids that have been associated with genome instability. Concordantly, we showed that FXS cells accumulate R-loops under replication stress. Moreover, expression of FMRP and not a mutant deficient in binding nucleic acids and known to cause FXS, FMRPI304N, reduced R-loop-associated DSBs. These observations demonstrated that FMRP promotes genome integrity by preventing R-loop accumulation and chromosome breakage. Here, we explore the mechanism through which FMRP prevents R-loop accumulation in an isogenically controlled CRISPR KO of FMR1 (gene encoding for FMRP) in HEK293T cells. We demonstrate for the first time that FMRP directly binds R-loops. We show that FMRP interacts with DHX9, an RNA helicase that unwinds both double strand RNA and RNA:DNA hybrids and regulates R-loop formation through modulating these activities. This interaction is reduced with FMRPI304N, suggesting that FMRP regulation of R-loop is mediated through DHX9. Interestingly, we show that FMRP inhibits DHX9 helicase activity on RNA:DNA hybrids. Moreover, DHX9 binds chromatin containing R-loops more efficiently in the absence of a functional FMRP. These results suggest an antagonistic relationship between FMRP and DHX9 at the chromatin, where FMRP prevents R-loop formation by suppressing DHX9. Our study sheds new light on our understanding of the genome functions of FMRP.

The cytoskeleton is a complex network of interconnected biopolymers consisting of actin filaments, microtubules, and intermediate filaments. These biopolymers work in concert to transmit cell-generated forces to the extracellular matrix required for cell motility, wound healing, and tissue maintenance. While we know cell-generated forces are driven by actomyosin contractility and balanced by microtubule network resistance, the effect of intermediate filaments on cellular forces is unclear. Using a combination of theoretical modeling and experiments, we show that vimentin intermediate filaments tune cell stress by assisting in both actomyosin-based force transmission and reinforcement of microtubule networks under compression. We show that the competition between these two opposing effects of vimentin is regulated by the microenvironment stiffness. These results reconcile seemingly contradictory results in the literature and provide a unified description of vimentin's effects on the transmission of cell contractile forces to the extracellular matrix.

SUMMARY The last stage of cell division involves two daughter cells remaining interconnected by a cytokinetic bridge that is cleaved in a process called abscission. During pre-abscission, we identified that the centrosome moves in a Rab11-dependent manner towards the cytokinetic bridge in human cells grown in culture and in an in vivo vertebrate model, Danio rerio (zebrafish). Rab11-endosomes are dynamically organized in a Rab11-GTP dependent manner at the centrosome during pre-abscission and this organization is required for the centrosome protein, pericentrin, to be enriched at the centrosome. Using zebrafish embryos, we found that reduction in pericentrin expression or optogenetically disrupting Rab11-endosome function inhibited centrosome movement towards the cytokinetic bridge and abscission resulting in daughter cells prone to being binucleated and/or having supernumerary centrosomes. These studies suggest that Rab11-endosomes contribute to centrosome function during pre-abscission by regulating pericentrin organization resulting in appropriate centrosome movement towards the cytokinetic bridge and subsequent abscission.

Cell polarity is important for controlling cell shape, motility and cell division processes. Vimentin intermediate filaments are important for cell migration and cell polarization in mesenchymal cells and assembly of vimentin and microtubule networks is dynamically coordinated, but the precise details of how vimentin mediates cell polarity remain unclear. Here, we characterize the effects of vimentin on the structure and function of the centrosome and the stability of microtubule filaments in wild-type and vimentin-null mouse embryonic fibroblasts. We find that vimentin mediates the structure of the pericentriolar material, promotes centrosome-mediated microtubule regrowth and increases the level of stable acetylated microtubules in the cell. Loss of vimentin also impairs centrosome repositioning during cell polarization and migration processes that occur during wound closure. Our results suggest that vimentin modulates centrosome structure and function as well as microtubule network stability, which has important implications for how cells establish proper cell polarization and persistent migration.

Abstract The ability of cells to take and change shape is a fundamental feature underlying development, wound repair, and tissue maintenance. Central to this process is physical and signaling interactions between the three cytoskeletal polymeric networks: F-actin, microtubules, and intermediate filaments (IFs). Vimentin is an IF protein that is essential to the mechanical resilience of cells and regulates cross-talk amongst the cytoskeleton, but its role in how cells sense and respond to the surrounding extracellular matrix is largely unclear. To investigate vimentin’s role in substrate sensing, we designed polyacrylamide hydrogels that mimic the elastic and viscoelastic nature of in vivo tissues. Using wild-type and vimentin-null mouse embryonic fibroblasts, we show that vimentin enhances cell spreading on viscoelastic substrates, even though it has little effect in the limit of purely elastic substrates. Our results provide compelling evidence that the vimentin cytoskeletal network is a physical modulator of how cells sense and respond to mechanical properties of their extracellular environment.

ABSTRACT An essential process during Danio rerio’s left-right organizer (Kupffer’s Vesicle, KV) development is for the majority of developing KV cells to form a motile cilium that extend into the KV lumen. Left-right beating of motile cilia within the KV lumen directs fluid flow to establishment the embryo’s left-right axis. However, when KV cells start to form cilia and how cilia formation is coordinated with KV lumen formation has not been examined. We identified that nascent KV cells form cilia at their centrosomes at random intracellular positions that then move towards a forming apical membrane containing cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Using optogenetic clustering approaches, we found that Rab35 positive membranes recruit Rab11 to modulate CFTR delivery to the apical membrane, which is required for lumen opening, and subsequent cilia extension into the lumenal cavity. Once the intracellular cilia reach the CFTR positive apical membrane, Arl13b-positive cilia extend and elongate in a Rab8 dependent manner into the forming lumen once the lumen reaches an area of 300 μm 2 . These studies demonstrate the need to acutely coordinate Rab8, Rab11, and Rab35-mediated membrane trafficking events to ensure appropriate timing in lumen and cilia formation during KV development.

Factors that regulate mitotic spindle positioning have been elucidated in vitro , however it remains unclear how a spindle is placed within the confines of extremely large cells. Our studies identified a uniquely large centrosome structure in the early zebrafish embryo (246.44 ±11.93 µm² mitotic centrosome in a 126.86 ±0.35 µm diameter cell), whereas C. elegans centrosomes are notably smaller (6.75 ±0.28 µm² mitotic centrosome in a 55.83 ±1.04 µm diameter cell). During early embryonic cell divisions, cell size changes rapidly in C. elegans and zebrafish embryos. Notably, mitotic centrosome area scales closely with changing cell size compared to changes in spindle length for both organisms. One interesting difference between the two is that mitotic centrosomes are asymmetric in size across embryonic zebrafish spindles, with the larger mitotic centrosome being 2.14 ±0.13-fold larger in size than the smaller. The largest mitotic centrosome is placed towards the embryo center in a Polo-Like Kinase (PLK) 1 and PLK4 dependent manner 87.14 ±4.16% of the time. We propose a model in which uniquely large centrosomes direct spindle placement within the disproportionately large zebrafish embryo cells to orchestrate cell divisions during early embryogenesis.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract Mutations in Ubiquilin-2 (UBQLN2), a ubiquitin-binding shuttle protein involved in several protein quality control processes, can lead to amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We previously found that wild-type UBQLN2 forms dynamic, membraneless biomolecular condensates upon cellular stress, and undergoes liquid-liquid phase separation in vitro . However, the impact of ALS-linked mutations on UBQLN2 condensate formation in cells is unknown. Here, we employ live-cell imaging with photokinetic analysis to investigate how five patient-derived ALS-linked mutations in UBQLN2 impact stress-induced UBQLN2 condensate assembly and condensate material properties. Both wild-type and mutant UBQLN2 condensates are generally cytoplasmic and liquid-like. However, cells transfected with mutant UBQLN2 contain fewer stress-induced UBQLN2 condensates than those with wild-type UBQLN2. Most strikingly, ectopically expressed P506T UBQLN2 forms the lowest number of stress-induced condensates of all UBQLN2 mutants, and these condensates are significantly smaller than those of wild-type UBQLN2. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analysis of UBQLN2 condensates revealed higher immobile fractions for UBQLN2 mutants, especially P506T. P497S and P497H mutations differentially impact condensate properties, demonstrating that the effects of ALS-linked mutations are both position- and amino acid-dependent. Collectively, our data show that disease mutations hinder assembly and alter viscoelastic properties of stress-induced UBQLN2 condensates, potentially leading to aggregates commonly observed in ALS.

Abstract Ghrelin O- acyltransferase (GOAT) plays a central role in the maturation and activation of the peptide hormone ghrelin, which performs a wide range of endocrinological signaling roles. Using a tight-binding fluorescent ghrelin-derived peptide designed for high selectivity for GOAT over the ghrelin receptor GHS-R1a, we demonstrate that GOAT interacts with extracellular ghrelin and facilitates ligand cell internalization in both transfected cells and prostate cancer cells endogenously expressing GOAT. Coupled with enzyme mutagenesis, ligand uptake studies provide the first direct evidence supporting interaction of the putative histidine general base within GOAT with the ghrelin peptide acylation site. Our work provides a new understanding of GOAT’s catalytic mechanism, establishes a key step required for autocrine/paracrine ghrelin signaling involving local reacylation by GOAT, and raises the possibility that other peptide hormones may exhibit similar complexity in their intercellular and organismal-level signaling pathways.

Fragile X syndrome (FXS) is the most prevalent inherited intellectual disability caused by mutations in the Fragile X Mental Retardation 1 ( FMR1 ) gene. The protein product of FMR1 , FMRP, is known as a translational repressor whose nuclear function is not understood. Here we report that FMRP is a genome maintenance protein. We show that FX cells exhibit elevated level of chromosome breaks, both spontaneous and replication stress-induced. We demonstrate that FMRP is required for abating R-loop accumulation, thereby preventing chromosome breakage. Through mapping FMRP-bound chromatin loci in normal cells and correlating with FX-specific chromosome breaks, we identified novel FXS-susceptible genes. We show that FX cells have reduced expression of the uridine diphosphoglucuronosyl transferase 1 family enzymes, suggesting defective xenobiotics glucuronidation and consequential neurotoxicity in FXS.