SUMMARY Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disease affecting social behavior. Many of the high-confident ASD risk genes relate to mRNA translation. Specifically, many of these genes are involved in regulation of gene expression for subcellular compartmentalization of proteins 1 . Cis-regulatory motifs that often localize to 3’- and 5’-untranslated regions (UTRs) offer an additional path for posttranscriptional control of gene expression. Alternative cleavage and polyadenylation (APA) affect 3’UTR length thereby influencing the presence or absence of regulatory elements. However, APA has not yet been addressed in the context of neurodevelopmental disorders. Here we used single cell 3’end sequencing to examine changes in 3’UTRs along the differentiation from neural stem cells (NSCs) to neuroblasts within the adult brain. We identified many APA events in genes involved in neurodevelopment, many of them being high confidence ASD risk genes. Further, analysis of 3’UTR lengths in single cells from ASD and healthy individuals detected longer 3’UTRs in ASD patients. Motif analysis of modulated 3’UTRs in the mouse adult neurogenic lineage and ASD-patients revealed enrichment of the cytoplasmic and polyadenylation element (CPE). This motif is bound by CPE binding protein 4 (CPEB4). In human and mouse data sets we observed co-regulation of CPEB4 and the CPEB-binding synaptic adhesion molecule amyloid beta precursor-like protein 1 (APLP1). We show that mice deficient in APLP1 show aberrant regulation of APA, decreased number of neural stem cells, and autistic-like traits. Our findings indicate that APA is used for control of gene expression along neuronal differentiation and is altered in ASD patients.

Abstract We have identified camelid single-domain antibodies (VHHs) that cross-neutralize SARS-CoV-1 and −2, such as VHH72, which binds to a unique highly conserved epitope in the viral receptor-binding domain (RBD) that is difficult to access for human antibodies. Here, we establish a protein engineering path for how a stable, long-acting drug candidate can be generated out of such a VHH building block. When fused to human IgG1-Fc, the prototype VHH72 molecule prophylactically protects hamsters from SARS-CoV-2. In addition, we demonstrate that both systemic and intranasal application protects hACE-2-transgenic mice from SARS-CoV-2 induced lethal disease progression. To boost potency of the lead, we used structure-guided molecular modeling combined with rapid yeast-based Fc-fusion prototyping, resulting in the affinity-matured VHH72_S56A-Fc, with subnanomolar SARS-CoV-1 and −2 neutralizing potency. Upon humanization, VHH72_S56A was fused to a human IgG1 Fc with optimized manufacturing homogeneity and silenced effector functions for enhanced safety, and its stability as well as lack of off-target binding was extensively characterized. Therapeutic systemic administration of a low dose of VHH72_S56A-Fc antibodies strongly restricted replication of both original and D614G mutant variants of SARS-CoV-2 virus in hamsters, and minimized the development of lung damage. This work led to the selection of XVR011 for clinical development, a highly stable anti-COVID-19 biologic with excellent manufacturability. Additionally, we show that XVR011 is unaffected in its neutralizing capacity of currently rapidly spreading SARS-CoV-2 variants, and demonstrate its unique, wide scope of binding across the Sarbecovirus clades.

Abstract In the standard toolkit for recombinant protein expression, the yeast known in biotechnology as Pichia pastoris (formally: Komagataella phaffii ) takes up the position between E. coli and HEK293 or CHO mammalian cells, and is used by thousands of laboratories both in academia and industry. The organism is eukaryotic yet microbial, and grows to extremely high cell densities while secreting proteins into its fully defined growth medium, using very well established strong inducible or constitutive promoters. Many products made in Pichia are in the clinic and in industrial markets. Pichia is also a favoured host for the rapidly emerging area of ‘precision fermentation’ for the manufacturing of food proteins. However, the earliest steps in the development of the industrial strain (NRRL Y-11430/CBS 7435) that is used throughout the world were performed prior to 1985 in industry (Phillips Petroleum Company) and are not in the public domain. Moreover, despite the long expiry of associated patents, the patent deposit NRRL Y-11430/CBS 7435 that is the parent to all commonly used industrial strains, is not or no longer made freely available through the resp. culture collections. This situation is far from ideal for what is a major chassis for synthetic biology, as it generates concern that novel applications of the system are still encumbered by licensing requirements of the very basic strains. In the spirit of open science and freedom to operate for what is a key component of biotechnology, we set out to resolve this by using genome sequencing of type strains, reverse engineering where necessary, and comparative protein expression and strain characterisation studies. We find that the industrial strains derive from the K. phaffii type strain lineage deposited as 54-11.239 in the UC Davis Phaff Yeast Strain collection by Herman Phaff in 1954. This type strain has valid equivalent deposits that are replicated/derived from it in other yeast strain collections, incl. in ARS-NRRL NRRL YB-4290 (deposit also made by Herman Phaff) and NRRL Y-7556, CBS 2612 and NCYC 2543. We furthermore discovered that NRRL Y-11430 and its derivatives carry an ORF-truncating mutation in the HOC1 cell wall synthesis gene, and that reverse engineering of a similar mutation in the NCYC 2543 type strain imparts the high transformability that is characteristic of the industrial strains. Uniquely, the NCYC 2543 type strain, which we propose to call ‘OPENPichia’ henceforth, is freely available from the NCYC culture collection, incl. resale and commercial production licenses at nominal annual licensing fees 1 . Furthermore, our not-for-profit research institute VIB has also acquired a resale/distribution license from NCYC, which we presently use to openly provide to end-users our genome-sequenced OPENPichia subclone strain and its derivatives, i.e., currently the highly transformable hoc1 tr and the his4 auxotrophic mutants. To complement the OPENPichia platform, a fully synthetic modular gene expression vector building toolkit was developed, which is also openly distributed, for any purpose. We invite other researchers to contribute to our open science resource-building effort to establish a new unencumbered standard chassis for Pichia synthetic biology.

Summary Protein-protein interactions play an important biological role in every aspect of cellular homeostasis and functioning. Proximity labeling mass spectrometry-based proteomics overcomes challenges typically associated with other methods, and has quickly become the current state-of-the-art in the field. Nevertheless, tight control of proximity labeling enzymatic activity and expression levels is crucial to accurately identify protein interactors. Here, we leverage a T2A self-cleaving peptide and a non-cleaving mutant to accommodate the protein-of-interest in the experimental and control TurboID setup. To allow easy and streamlined plasmid assembly, we built a Golden Gate modular cloning system to generate plasmids for transient expression and stable integration. To highlight our T2A Split-link design, we applied it to identify protein interactions of the glucocorticoid receptor and SARS-CoV-2 nucleocapsid and NSP7 proteins by TurboID proximity labeling. Our results demonstrate that our T2A split-link provides an opportune control that builds upon previously established control requirements in the field. Motivation In proximity labeling proteomics protein-protein interactions are identified by in vivo biotinylation. However, the current lack of a universally applicable negative control for differential analysis affects accurate mapping of the interactome. To bridge this gap, we conceptualized a system based on the T2A self-cleaving peptide to match expression levels between control and bait protein setups while using the same bait protein. In addition, we implemented a versatile modular cloning system to build mammalian expression vectors for, but not limited to, proximity labeling assays.

Abstract The peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) is a crucial transcription factor governing genes associated with fatty acid β-oxidation. How various interacting proteins modulate PPARα’s transcriptional function remains incompletely understood. Employing an unbiased mammalian protein-protein interaction trap with liganded PPARα as bait, we identified an interaction with the orphan nuclear receptor estrogen-related receptor α (ERRα). Random mutagenesis scanning of PPARα’s ligand-binding domain and coregulator profiling experiments implicated bridging coregulators, while in vitro studies suggested a trimeric interaction involving RXRα. The PPARα·ERRα interaction, dependent on three C-terminal residues within ERRα’s helix 12, was reinforced by PGC1α and serum deprivation. Pharmacological inhibition of ERRα reduced its interaction with ligand-activated PPARα, revealing a transcriptome indicative of ERRα functioning as a transcriptional repressor on prototypical PPARα target genes. Intriguingly, ERRα exhibited opposite behavior on other PPARα targets, including the isolated PDK4 enhancer. Chromatin immunoprecipitation analyses demonstrated PPARα ligand-dependent recruitment of ERRα onto specific chromatin regions where PPARα binds in mouse livers. These findings highlight intricate transcriptional crosstalk mechanisms between PPARα and ERRα, suggesting a multi-layered regulatory network fine-tuning PPARα’s activity as a nutrient-sensing transcription factor.

Abstract Ribosome profiling has revealed translation outside of canonical coding sequences (CDSs) including translation of short upstream ORFs, long non-coding RNAs, overlapping ORFs, ORFs in UTRs or ORFs in alternative reading frames. Studies combining mass spectrometry, ribosome profiling and CRISPR-based screens showed that hundreds of ORFs derived from non-coding transcripts produce (micro)proteins, while other studies failed to find evidence for such types of non-canonical translation products. Here, we attempted to discover translation products from non-coding regions by strongly reducing the complexity of the sample prior to mass spectrometric analysis. We used an extended database as the search space and applied stringent filtering of the identified peptides to find evidence for novel translation events. Theoretically, we show that our strategy facilitates the detection of translation events of transcripts from non-coding regions, but experimentally only find 19 peptides (less than 1% of all identified peptides) that might originate from such translation events. Virotrap based interactome analysis of two N-terminal proteoforms originating from non-coding regions finally showed the functional potential of these novel proteins.

Abstract Monoclonal antibodies are the leading drug of the biopharmaceutical market because of their high specificity and tolerability, but the current CHO-based manufacturing platform remains expensive and time-consuming leading to limited accessibility, especially in the case of diseases with high incidence and pandemics. Therefore, there is an urgent need for an alternative production system. In this study, we present a rapid and cost-effective microbial platform for heavy chain-only antibodies (VHH-Fc) in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (aka Pichia pastoris ). We demonstrate the potential of this platform using a simplified single-gene VHH-Fc fusion construct instead of the conventional monoclonal antibody format, as this is more easily expressed in Pichia pastoris . We demonstrate that the Pichia -produced VHH-Fc fusion construct is stable and that a Pichia -produced VHH-Fc directed against the SARS-CoV-2 spike has potent SARS-CoV-2 neutralizing activity in vitro and in vivo . We expect that this platform will pave the way towards faster and cheaper development and production of broadly neutralizing single-chain antibodies in yeast.

Abstract The glucocorticoid receptor (GR) is a crucial drug target in multiple myeloma as its activation with glucocorticoids effectively triggers myeloma cell death. However, as high-dose glucocorticoids are also associated with deleterious side effects, novel approaches are urgently needed to improve GR action in myeloma. Here we reveal a functional crosstalk between GR and the mineralocorticoid receptor (MR) that culminates in improved myeloma cell killing. We show that the GR agonist Dexamethasone (Dex) downregulates MR levels in a GR-dependent way in myeloma cells. Co-treatment of Dex with the MR antagonist Spironolactone (Spi) enhances Dex-induced cell killing in primary, newly diagnosed GC-sensitive myeloma cells. In a relapsed GC-resistant setting, Spi alone induces distinct myeloma cell killing. On a mechanistic level, we find that a GR-MR crosstalk likely arises from an endogenous interaction between GR and MR in myeloma cells. Quantitative dimerization assays show that Spi reduces Dex-induced GR-MR heterodimerization and completely abolishes Dex-induced MR-MR homodimerization, while leaving GR-GR homodimerization intact. Unbiased transcriptomics analyses reveal that c-myc and many of its target genes are downregulated most by combined Dex-Spi treatment. Proteomics analyses further identify that several metabolic hallmarks are modulated most by this combination treatment. Finally, we identified a subset of Dex-Spi downregulated genes and proteins that may predict prognosis in the CoMMpass myeloma patient cohort. Our study demonstrates that GR-MR crosstalk is therapeutically relevant in myeloma as it provides novel strategies for glucocorticoid-based dose-reduction.

Abstract Alternative translation initiation and alternative splicing may give rise to N-terminal proteoforms, proteins that differ at their N-terminus compared to their canonical counterparts. Such proteoforms can have altered localizations, stabilities and functions. While proteoforms generated from splice variants can be engaged in different protein complexes, it remained to be studied to what extent this applies to N-terminal proteoforms. To address this, we mapped the interactomes of several pairs of N-terminal proteoforms and their canonical counterparts. First, we generated a catalogue of N-terminal proteoforms found in the HEK293T cellular cytosol from which 22 pairs were selected for interactome profiling. Additionally, we provide evidence for the expression of several N-terminal proteoforms, identified in our catalogue, across different human tissues as well as tissue-specific expression, highlighting their biological relevance. Protein-protein interaction profiling revealed that the overlap of the interactomes for both proteoforms is generally high, showing their functional relation. We also showed that N-terminal proteoforms can be engaged in new interactions and/or lose several interactions compared to their canonical counterpart, thus further expanding the functional diversity of proteomes.

Abstract Currently circulating SARS-CoV-2 variants have gained complete or significant resistance to all SARS-CoV-2-neutralizing antibodies that have been used in the clinic. Such antibodies can prevent severe disease in SARS-CoV-2 exposed patients for whom vaccines may not provide optimal protection. Here, we describe single-domain antibodies (VHHs), also known as nanobodies, that can broadly neutralize SARS-CoV-2 with unusually high potency. Structural analysis revealed their binding to a unique, highly conserved, membrane proximal, quaternary epitope in the S2 subunit of the spike. Furthermore, a VHH-human IgG1 Fc fusion, efficiently expressed in Chinese hamster ovary cells as a stable antibody construct, protected hamsters against SARS-CoV-2 replication in a therapeutic setting when administered systemically at low dose. This VHH-based antibody represents a new candidate anti-COVID-19 biologic that targets the Achilles heel of the viral spike.