Extracellular vesicles (EVs) have emerged as important mediators of intercellular communication in a diverse range of biological processes. For future therapeutic applications and for EV biology research in general, understanding the in vivo fate of EVs is of utmost importance. Here we studied biodistribution of EVs in mice after systemic delivery. EVs were isolated from 3 different mouse cell sources, including dendritic cells (DCs) derived from bone marrow, and labelled with a near-infrared lipophilic dye. Xenotransplantation of EVs was further carried out for cross-species comparison. The reliability of the labelling technique was confirmed by sucrose gradient fractionation, organ perfusion and further supported by immunohistochemical staining using CD63-EGFP probed vesicles. While vesicles accumulated mainly in liver, spleen, gastrointestinal tract and lungs, differences related to EV cell origin were detected. EVs accumulated in the tumour tissue of tumour-bearing mice and, after introduction of the rabies virus glycoprotein-targeting moiety, they were found more readily in acetylcholine-receptor-rich organs. In addition, the route of administration and the dose of injected EVs influenced the biodistribution pattern. This is the first extensive biodistribution investigation of EVs comparing the impact of several different variables, the results of which have implications for the design and feasibility of therapeutic studies using EVs.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) play a pivotal role in cell-to-cell communication and have been shown to take part in several physiological and pathological processes. EVs have traditionally been purified by ultracentrifugation (UC), however UC has limitations, including resulting in, operator-dependant yields, EV aggregation and altered EV morphology, and moreover is time consuming. Here we show that commercially available bind-elute size exclusion chromatography (BE-SEC) columns purify EVs with high yield (recovery ~ 80%) in a time-efficient manner compared to current methodologies. This technique is reproducible and scalable, and surface marker analysis by bead-based flow cytometry revealed highly similar expression signatures compared with UC-purified samples. Furthermore, uptake of eGFP labelled EVs in recipient cells was comparable between BE-SEC and UC samples. Hence, the BE-SEC based EV purification method represents an important methodological advance likely to facilitate robust and reproducible studies of EV biology and therapeutic application.

Extracellular vesicles (EVs) can be harvested from cell culture supernatants and from all body fluids. EVs can be conceptually classified based on their size and biogenesis as exosomes and microvesicles. Nowadays, it is however commonly accepted in the field that there is a much higher degree of heterogeneity within these two subgroups than previously thought. For instance, the surface marker profile of EVs is likely dependent on the cell source, the cell's activation status, and multiple other parameters. Within recent years, several new methods and assays to study EV heterogeneity in terms of surface markers have been described; most of them are being based on flow cytometry. Unfortunately, such methods generally require dedicated instrumentation, are time-consuming and demand extensive operator expertise for sample preparation, acquisition, and data analysis. In this study, we have systematically evaluated and explored the use of a multiplex bead-based flow cytometric assay which is compatible with most standard flow cytometers and facilitates a robust semi-quantitative detection of 37 different potential EV surface markers in one sample simultaneously. First, assay variability, sample stability over time, and dynamic range were assessed together with the limitations of this assay in terms of EV input quantity required for detection of differently abundant surface markers. Next, the potential effects of EV origin, sample preparation, and quality of the EV sample on the assay were evaluated. The findings indicate that this multiplex bead-based assay is generally suitable to detect, quantify, and compare EV surface signatures in various sample types, including unprocessed cell culture supernatants, cell culture-derived EVs isolated by different methods, and biological fluids. Furthermore, the use and limitations of this assay to assess heterogeneities in EV surface signatures was explored by combining different sets of detection antibodies in EV samples derived from different cell lines and subsets of rare cells. Taken together, this validated multiplex bead-based flow cytometric assay allows robust, sensitive, and reproducible detection of EV surface marker expression in various sample types in a semi-quantitative way and will be highly valuable for many researchers in the EV field in different experimental contexts.

Extracellular vesicles (EVs) are naturally occurring nano-sized carriers that are secreted by cells and facilitate cell-to-cell communication by their unique ability to transfer biologically active cargo. Despite the pronounced increase in our understanding of EVs over the last decade, from disease pathophysiology to therapeutic drug delivery, improved molecular tools to track their therapeutic delivery are still needed. Unfortunately, the present catalogue of tools utilised for EV labelling lacks sensitivity or are not sufficiently specific. Here, we have explored the bioluminescent labelling of EVs using different luciferase enzymes tethered to CD63 to achieve a highly sensitive system for in vitro and in vivo tracking of EVs. Using tetraspanin fusions to either NanoLuc or ThermoLuc permits performing highly sensitive in vivo quantification of EVs or real-time imaging, respectively, at low cost and in a semi-high throughput manner. We find that the in vivo distribution pattern of EVs is determined by the route of injection, but that different EV subpopulations display differences in biodistribution patterns. By applying this technology for real-time non-invasive in vivo imaging of EVs, we show that their distribution to different internal organs occurs just minutes after administration.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) play a key role in many physiological and pathophysiological processes and hold great potential for therapeutic and diagnostic use. Despite significant advances within the last decade, the key issue of EV storage stability remains unresolved and under investigated. Here, we aimed to identify storage conditions stabilizing EVs and comprehensively compared the impact of various storage buffer formulations at different temperatures on EVs derived from different cellular sources for up to 2 years. EV features including concentration, diameter, surface protein profile and nucleic acid contents were assessed by complementary methods, and engineered EVs containing fluorophores or functionalized surface proteins were utilized to compare cellular uptake and ligand binding. We show that storing EVs in PBS over time leads to drastically reduced recovery particularly for pure EV samples at all temperatures tested, starting already within days. We further report that using PBS as diluent was found to result in severely reduced EV recovery rates already within minutes. Several of the tested new buffer conditions largely prevented the observed effects, the lead candidate being PBS supplemented with human albumin and trehalose (PBS‐HAT). We report that PBS‐HAT buffer facilitates clearly improved short‐term and long‐term EV preservation for samples stored at ‐80°C, stability throughout several freeze‐thaw cycles, and drastically improved EV recovery when using a diluent for EV samples for downstream applications.

ABSTRACT Extracellular vesicles (EV) convey biological information by transmitting macromolecules between cells and tissues and are of great promise as pharmaceutical nanocarriers, and as therapeutic per se. Strategies for customizing the EV surface and cargo are being developed to enable their tracking, visualization, loading with pharmaceutical agents and decoration of the surface with tissue targeting ligands. While much progress has been made in the engineering of EVs, an exhaustive comparative analysis of the most commonly exploited EV‐associated proteins, as well as a quantification at the molecular level are lacking. Here, we selected 12 EV‐related proteins based on MS‐proteomics data for comparative quantification of their EV engineering potential. All proteins were expressed with fluorescent protein (FP) tags in EV‐producing cells; both parent cells as well as the recovered vesicles were characterized biochemically and biophysically. Using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) we quantified the number of FP‐tagged molecules per vesicle. We observed different loading efficiencies and specificities for the different proteins into EVs. For the candidates showing the highest loading efficiency in terms of engineering, the molecular levels in the vesicles did not exceed ca 40–60 fluorescent proteins per vesicle upon transient overexpression in the cells. Some of the GFP‐tagged EV reporters showed quenched fluorescence and were either non‐vesicular, despite co‐purification with EVs, or comprised a significant fraction of truncated GFP. The co‐expression of each target protein with CD63 was further quantified by widefield and confocal imaging of single vesicles after double transfection of parent cells. In summary, we provide a quantitative comparison for the most commonly used sorting proteins for bioengineering of EVs and introduce a set of biophysical techniques for straightforward quantitative and qualitative characterization of fluorescent EVs to link single vesicle analysis with single molecule quantification.

Extracellular vesicles (EVs) can be functionalized to display specific protein receptors on their surface. However, surface-display technology typically labels only a small fraction of the EV population. Here, we show that the joint display of two different therapeutically relevant protein receptors on EVs can be optimized by systematically screening EV-loading protein moieties. We used cytokine-binding domains derived from tumour necrosis factor receptor 1 (TNFR1) and interleukin-6 signal transducer (IL-6ST), which can act as decoy receptors for the pro-inflammatory cytokines tumour necrosis factor alpha (TNF-α) and IL-6, respectively. We found that the genetic engineering of EV-producing cells to express oligomerized exosomal sorting domains and the N-terminal fragment of syntenin (a cytosolic adaptor of the single transmembrane domain protein syndecan) increased the display efficiency and inhibitory activity of TNFR1 and IL-6ST and facilitated their joint display on EVs. In mouse models of systemic inflammation, neuroinflammation and intestinal inflammation, EVs displaying the cytokine decoys ameliorated the disease phenotypes with higher efficacy as compared with clinically approved biopharmaceutical agents targeting the TNF-α and IL-6 pathways.

Extracellular vesicles (EVs) are nanosized cell-derived vesicles produced by all cells, which provide a route of intercellular communication by transmitting biological cargo. While EVs offer promise as therapeutic agents, the molecular mechanisms of EV biogenesis are not yet fully elucidated, in part due to the concurrence of numerous interwoven pathways which give rise to heterogenous EV populations in vitro. The equilibrium between the EV-producing pathways is heavily influenced by factors in the extracellular environment, in such a way that can be taken advantage of to boost production of engineered EVs. In this study, a quantifiable EV-engineering approach is used to investigate how different cell media conditions alter EV production. The presence of serum, exogenous EVs, and other signaling factors in cell media alters EV production at the physical, molecular, and transcriptional levels. Further, it is demonstrated that the ceramide-dependent EV biogenesis route is the major pathway to production of engineered EVs during optimized EV-production. These findings suggest a novel understanding to the mechanisms underlying EV production in cell culture which can be applied to develop advanced EV production methods.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) have recently emerged as a highly promising cell-free bio-therapeutics. While a range of engineering strategies have been developed to functionalize the EV surface, current approaches fail to address the limitations associated with endogenous surface display, pertaining to the heterogeneous display of commonly used EV-loading moieties among different EV subpopulations. Here we present a novel engineering platform to display multiple protein therapeutics simultaneously on the EV surface. As proof-of-concept, we screened multiple endogenous display strategies for decorating the EV surface with cytokine binding domains derived from tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) and interleukin 6 signal transducer (IL6ST), which can act as decoys for the pro-inflammatory cytokines TNFα and IL6, respectively. Combining synthetic biology and systematic screening of loading moieties, resulted in a three-component system which increased the display and decoy activity of TNFR1 and IL6ST, respectively. Further, this system allowed for combinatorial functionalization of two different receptors on the same EV surface. These cytokine decoy EVs significantly ameliorated disease phenotypes in three different inflammatory mouse models for systemic inflammation, neuroinflammation, and intestinal inflammation. Importantly, significantly improved in vitro and in vivo efficacy of these engineered EVs was observed when compared directly to clinically approved biologics targeting the IL6 and TNFα pathways.

ABSTRACT Messenger RNA (mRNA) has emerged as an attractive therapeutic molecule for a range of clinical applications. For in vivo functionality, mRNA therapeutics require encapsulation into effective, stable, and safe delivery systems to protect the cargo from degradation and reduce immunogenicity. Here, a bioengineering platform for efficient mRNA loading and functional mRNA delivery was developed using extracellular vesicles (EVs) as naturally derived nanoparticles. Engineered EVs carrying the highly specific PUFe RNA-binding domain fused to CD63 were produced in cells stably expressing the target mRNA with compatible binding sites. Using this system, the target mRNA was actively loaded into the produced EVs during EV biogenesis with loading efficiencies exceeding those previously reported for other EV- based approaches. In combination with the expression of an mRNA-stabilizing protein, PABPc, and a fusogenic endosomal escape moiety, VSVg, functional extrahepatic mRNA delivery via EVs in vivo was achieved at mRNA doses substantially lower than currently used for lipid nanoparticles. Our technology overcomes major limitations currently associated with EV-based nucleic acid delivery systems and could enable new applications for mRNA therapeutics. TABLE OF CONTENTS This study developed a novel system for highly efficient mRNA loading using engineered extracellular vesicles (EVs). The synergic components of the mRNA loading platform also solve limitations in delivery by supporting mRNA stability and translation, as well as endosomal escape in recipient cells. Thus, functional mRNA delivery is achieved at mRNA doses substantially lower than currently used for lipid nanoparticles.