Mammalian telomeres contain a duplex array of telomeric repeats bound to the telomeric repeat–binding factors TRF1 and TRF2. Inhibition of TRF2 results in immediate deprotection of chromosome ends, manifested by loss of the telomeric 3′ overhang, activation of p53, and end-to-end chromosome fusions. Electron microscopy reported here demonstrated that TRF2 can remodel linear telomeric DNA into large duplex loops (t loops) in vitro. Electron microscopy analysis of psoralen cross-linked telomeric DNA purified from human and mouse cells revealed abundant large t loops with a size distribution consistent with their telomeric origin. Binding of TRF1 and single strand binding protein suggested that t loops are formed by invasion of the 3′ telomeric overhang into the duplex telomeric repeat array. T loops may provide a general mechanism for the protection and replication of telomeres.

Telomere length in human cells is controlled by a homeostasis mechanism that involves telomerase and the negative regulator of telomere length, TRF1 (TTAGGG repeat binding factor 1).Here we report that TRF2, a TRF1-related protein previously implicated in protection of chromosome ends, is a second negative regulator of telomere length.Overexpression of TRF2 results in the progressive shortening of telomere length, similar to the phenotype observed with TRF1.However, while induction of TRF1 could be maintained over more than 300 population doublings and resulted in stable, short telomeres, the expression of exogenous TRF2 was extinguished and the telomeres eventually regained their original length.Consistent with their role in measuring telomere length, indirect immunofluorescence indicated that both TRF1 and TRF2 bind to duplex telomeric DNA in vivo and are more abundant on telomeres with long TTAGGG repeat tracts.Neither TRF1 nor TRF2 affected the expression level of telomerase.Furthermore, the presence of TRF1 or TRF2 on a short linear telomerase substrate did not inhibit the enzymatic activity of telomerase in vitro.These findings are consistent with the recently proposed t loop model of telomere length homeostasis in which telomerasedependent telomere elongation is blocked by sequestration of the 3 telomere terminus in TRF1-and TRF2induced telomeric loops.

Abstract The MRN complex (MRX in Saccharomyces cerevisiae ) initiates the repair of DNA double-stranded breaks (DSBs) and activates the Tel1/ATM kinase, which orchestrates the DNA damage response (DDR). Telomeres prevent DDR activation at chromosome ends, partly by keeping MRN-ATM in check. We show that the multiple activities of the MRX complex are disabled by telomeric protein Rif2 through the action of a short motif (MIN, M RN/X- in hibitory motif) at the N-terminal end of the protein. MIN executes telomeric suppression of Tel1, DDR and and non-homologous end joining (NHEJ) via direct biding to the N-terminal region of Rad50. A combination of biochemical and genetic data suggests that Rif2 promotes a transition within the MRX complex that is not conductive for endonuclease activity, DNA-end tethering or Tel1 kinase activation. We suggests that the MIN motif operates in the RIF2 paralog ORC4 (Origin Recognition Complex 4) in K. lactis and in telomeric protein Taz1 in Schizoccharomyces pombe , which is not evolutionarily related to Orc4/Rif2. These results highlight a potential Achilles’ heel in Rad50, the regulatory subunit of MRN, which we suggest has been targeted by different telomeric factors in multiple fungal lineages, raising the possibility that analogous approaches might be deployed in other Eukaryotes as well.

ABSTRACT Telomeres protect chromosome ends from unscheduled DNA repair, including from the MRN (MRE11, RAD50, NBS1) complex, which plays a critical role in the processing of double-stranded DNA breaks (DSBs). MRN orchestrates activation of the ATM kinase in the cellular DNA damage response (DDR), promotes DNA end-tethering aiding the nonhomologous end joining (NHEJ) pathway, and initiates DSB resection through the MRE11 nuclease. A previously identified protein motif (MIN, for MRN inhibitor) downregulates MRN activity via binding to RAD50 and has independently arisen at least twice, through convergent evolution of telomeric proteins Rif2 and Taz1, in budding and fission yeast respectively. We now provide a third example of convergent evolution for this binding mechanism for MRN at telomeres, by demonstrating that the iDDR motif of the human shelterin protein TRF2 binds to human RAD50 at the same site engaged by the MIN motif in the yeast proteins, despite lacking sequence homology. Modelling for the human CtIP interaction with RAD50 (necessary for activation of MRE11), and for the budding and fission yeast counterparts Sae2 and Ctp1, indicates that the interaction is mutually exclusive with binding of the iDDR/MIN motifs, pointing to a conserved mechanism for inhibition of MRN nuclease activity at telomeres.

Abstract Telomeres protect chromosome ends from unscheduled DNA repair, including from the MRN (MRE11, RAD50, NBS1) complex, which processes double-stranded DNA breaks (DSBs) via activation of the ATM kinase, promotes DNA end-tethering aiding the non-homologous end-joining (NHEJ) pathway, and initiates DSB resection through the MRE11 nuclease. A protein motif (MIN, for MRN inhibitor) inhibits MRN at budding yeast telomeres by binding to RAD50 and evolved at least twice, in unrelated telomeric proteins Rif2 and Taz1. We identify the iDDR motif of human shelterin protein TRF2 as a third example of convergent evolution for this telomeric mechanism for binding MRN, despite the iDDR lacking sequence homology to the MIN motif. CtIP is required for activation of MRE11 nuclease action, and we provide evidence for binding of a short C-terminal region of CtIP to a RAD50 interface that partly overlaps with the iDDR binding site, indicating that the interaction is mutually exclusive. In addition, we show that the iDDR impairs the DNA binding activity of RAD50. These results highlight direct inhibition of MRN action as a crucial role of telomeric proteins across organisms and point to multiple mechanisms enforced by the iDDR to disable the many activities of the MRN complex.