Abstract Selectively-bred High Responder (bHR) and Low Responder (bLR) rats model the extreme externalizing and internalizing behavior accompanying many psychiatric disorders. To elucidate gene expression underlying these heritable behavioral differences, bHRs and bLRs (generation 37) were used to produce a F 0 -F 1 -F 2 cross. We measured exploratory locomotion, anxiety-like behavior, and reward cue sensitivity (Pavlovian Conditioned Approach), and performed hippocampal RNA-Seq in male and female F 0 s (n=24) and F 2 s (n=250). Behaviors that diverged during selective breeding remained correlated in F 2 s, implying a shared genetic basis. F 0 bHR/bLR differential expression was robust, surpassing differences associated with sex, and predicted expression patterns associated with F2 behavior. With bHR-like behavior, gene sets related to growth/proliferation were upregulated, whereas with bLR-like behavior, gene sets related to mitochondrial function, oxidative stress, and microglial activation were upregulated. This differential expression could be successfully predicted based on F0 genotype using cis-expression quantitative trait loci (cis-eQTLs) identified in the F2s. Colocalization of these cis-eQTLs with behavioral Quantitative Trait Loci pinpointed 16 differentially expressed genes that were strong candidates for mediating the influence of genetic variation on behavioral temperament. Our findings implicate hippocampal bioenergetic regulation of oxidative stress, microglial activation, and growth-related processes in shaping behavioral temperament, modulating vulnerability to psychiatric disorders.

Abstract Heterogeneous Stock (HS) rats are a genetically diverse outbred rat population that is widely used for studying genetics of behavioral and physiological traits. Mapping Quantitative Trait Loci (QTL) associated with transcriptional changes would help to identify mechanisms underlying these traits. We generated genotype and transcriptome data for five brain regions from 88 HS rats. We identified 21,392 cis-QTLs associated with expression and splicing changes across all five brain regions and validated their effects using allele specific expression data. We identified 80 cases where eQTLs were colocalized with genome-wide association study (GWAS) results from nine physiological traits. Comparing our dataset to human data from the Genotype-Tissue Expression (GTEx) project, we found that the HS rat data yields twice as many significant eQTLs as a similarly sized human dataset. We also identified a modest but highly significant correlation between genetic regulatory variation among orthologous genes. Surprisingly, we found less genetic variation in gene regulation in HS rats relative to humans, though we still found eQTLs for the orthologs of many human genes for which eQTLs had not been found. These data are available from the RatGTEx data portal ( RatGTEx.org ) and will enable new discoveries of the genetic influences of complex traits.

Abstract The amygdala processes positive and negative valence and contributes to the development of addiction, but the underlying cell type-specific gene regulatory programs are unknown. We generated an atlas of single nucleus gene expression and chromatin accessibility in the amygdala of outbred rats with low and high cocaine addiction-like behaviors following prolonged abstinence. Between rats with different addiction indexes, we identified thousands of cell type-specific differentially expressed genes enriched for energy metabolism-related pathways that are known to affect synaptic transmission and action potentials. Rats with high addiction-like behaviors showed enhanced GABAergic transmission in the amygdala, which, along with relapse-like behaviors, were reversed by inhibition of Glyoxalase 1, which metabolizes the GABA A receptor agonist methylglyoxal. Finally, we identified thousands of cell type-specific chromatin accessible sites and transcription factor (TF) motifs where accessibility was associated with addiction index, most notably at motifs for pioneer TFs in the Fox, Sox, helix-loop-helix, and AP1 families.

Abstract We developed a framework for identifying trait-associated genes in rats and facilitating the transfer of polygenic evidence across species by expanding the transcriptome-wide association (TWAS) approach to rats. Our analysis successfully trained transcript predictors for over 8000 genes in each of the five brain regions of rats, revealing several shared properties of gene regulation with humans. Moreover, mirroring trends observed in humans, our findings showed that sparse predictors using variants in cis are more effective than polygenic predictors and that gene expression prediction in rats is highly correlated across brain regions. Importantly, our analysis also identified a significant overlap between genes associated with rat and human body length and BMI, indicating rat models may be useful for studying the genetic basis of complex traits in humans. RatXcan represents a valuable tool for uncovering shared biological mechanisms of complex traits across species, with potential applications in a wide range of research fields.

Abstract Transcriptome data is commonly used to understand genome function via quantitative trait loci (QTL) mapping and to identify the molecular mechanisms driving genome wide association study (GWAS) signals through colocalization analysis and transcriptome-wide association studies (TWAS). While RNA sequencing (RNA-seq) has the potential to reveal many modalities of transcriptional regulation, such as various splicing phenotypes, such studies are often limited to gene expression due to the complexity of extracting and analyzing multiple RNA phenotypes. Here, we present Pantry (Pan-transcriptomic phenotyping), a framework to efficiently generate diverse RNA phenotypes from RNA-seq data and perform downstream integrative analyses with genetic data. Pantry currently generates phenotypes from six modalities of transcriptional regulation (gene expression, isoform ratios, splice junction usage, alternative TSS/polyA usage, and RNA stability) and integrates them with genetic data via QTL mapping, TWAS, and colocalization testing. We applied Pantry to Geuvadis and GTEx data, and found that 4,768 of the genes with no identified expression QTL in Geuvadis had QTLs in at least one other transcriptional modality, resulting in a 66% increase in genes over expression QTL mapping. We further found that QTLs exhibit modality-specific functional properties that are further reinforced by joint analysis of different RNA modalities. We also show that generalizing TWAS to multiple RNA modalities (xTWAS) approximately doubles the discovery of unique gene-trait associations, and enhances identification of regulatory mechanisms underlying GWAS signal in 42% of previously associated gene-trait pairs. We provide the Pantry code, RNA phenotypes from all Geuvadis and GTEx samples, and xQTL and xTWAS results on the web.

Abstract Elevated intraocular pressure (IOP) is influenced by environmental and genetic factors. Increased IOP is a major risk factor for most types of glaucoma, including primary open angle glaucoma (POAG). Investigating the genetic basis of IOP may lead to a better understanding of the molecular mechanisms of POAG. The goal of this study was to identify genetic loci involved in regulating IOP using outbred heterogeneous stock (HS) rats. HS rats are a multigenerational outbred population derived from eight inbred strains that have been fully sequenced. This population is ideal for genome-wide association studies (GWASs) owing to the accumulated recombinations among well-defined haplotypes, the relatively high allele frequencies, the accessibility to a large collection of tissue samples, and the large allelic effect size compared to human studies. Both male and female HS rats (N=1,812) were used in the study. Genotyping-by-sequencing was used to obtain ~3.5 million single nucleotide polymorphisms (SNP) from each individual. SNP heritability for IOP in HS rats was 0.32, which agrees with other studies. We performed a GWAS for the IOP phenotype using a linear mixed model and used permutation to determine a genome-wide significance threshold. We identified three genome-wide significant loci for IOP on chromosomes 1, 5, and 16. Next, we sequenced the mRNA of 51 whole eye samples to find cis-eQTLs to aid in identification of candidate genes. We report 5 candidate genes within those loci: Tyr , Ctsc , Plekhf2 , Ndufaf6 and Angpt2 . Tyr , Ndufaf6 and Angpt2 genes have been previously implicated by human GWAS of IOP-related conditions. Ctsc and Plekhf2 genes represent novel findings that may provide new insight into the molecular basis of IOP. This study highlights the efficacy of HS rats for investigating the genetics of elevated IOP and identifying potential candidate genes for future functional testing. Contribution to the field statement Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. Intraocular pressure (IOP) is the only known modifiable risk factor. This study describes results of the genome-wide association study (GWAS) performed in outbred rats that identifies known and novel genes involved in IOP regulation. To our knowledge, this is the first GWAS performed for IOP in a rat model. Identifying novel candidate genes in the rat model provides insight into the risk factors for glaucoma in humans and potential pharmacological targets for regulating IOP. The rat model is advantageous for studying natural variations in IOP, controlling environmental exposures, and providing easier access to tissue that can be used in phenotyping and gene expression in future studies.

Genome-wide association studies typically evaluate the autosomes and sometimes the X Chromosome, but seldom consider the Y or mitochondrial Chromosomes. We genotyped the Y and mitochondrial chromosomes in heterogeneous stock rats (Rattus norvegicus), which were created in 1984 by intercrossing eight inbred strains and have subsequently been maintained as an outbred population for 100 generations. As the Y and mitochondrial Chromosomes do not recombine, we determined which founder had contributed these chromosomes for each rat, and then performed association analysis for all complex traits (n=12,055; intersection of 12,116 phenotyped and 15,042 haplotyped rats). We found the eight founders had 8 distinct Y and 4 distinct mitochondrial Chromosomes, however only two of each were observed in our modern heterogeneous stock rat population (Generations 81-97). Despite the unusually large sample size, the p-value distribution did not deviate from expectations; there were no significant associations for behavioral, physiological, metabolome, or microbiome traits after correcting for multiple comparisons. However, both Y and mitochondrial Chromosomes were strongly associated with expression of a few genes located on those chromosomes, which provided a positive control. Our results suggest that within modern heterogeneous stock rats there are no Y and mitochondrial Chromosomes differences that strongly influence behavioral or physiological traits. These results do not address other ancestral Y and mitochondrial Chromosomes that do not appear in modern heterogeneous stock rats, nor do they address effects that may exist in other rat populations, or in other species.

Abstract Power analyses are often used to determine the number of animals required for a genome wide association analysis (GWAS). These analyses are typically intended to estimate the sample size needed for at least one locus to exceed a genome-wide significance threshold. A related question that is less commonly considered is the number of significant loci that will be discovered with a given sample size. We used simulations based on a real dataset that consisted of 3,173 male and female adult N/NIH heterogeneous stock (HS) rats to explore the relationship between sample size and the number of significant loci discovered. Our simulations examined the number of loci identified in sub-samples of the full dataset. The sub-sampling analysis was conducted for four traits with low (0.15 ± 0.03), medium (0.31 ± 0.03 and 0.36 ± 0.03) and high (0.46 ± 0.03) SNP-based heritabilities. For each trait, we sub-sampled the data 100 times at different sample sizes (500, 1,000, 1,500, 2,000, and 2,500). We observed an exponential increase in the number of significant loci with larger sample sizes. Our results are consistent with similar observations in human GWAS and imply that future rodent GWAS should use sample sizes that are significantly larger than those needed to obtain a single significant result.

Histological images are used to identify and to characterize complex phenotypes such as tumor stage. Our goal is to associate histological image phenotypes with high-dimensional genomic markers; the limitations to incorporating histological image phenotypes in genomic studies are that the relevant image features are difficult to identify and extract in an automated way, and confounders are difficult to control in this high-dimensional setting. In this paper, we use convolutional autoencoders and sparse canonical correlation analysis (CCA) on histological images and gene expression levels from paired samples to find subsets of genes whose expression values in a tissue sample correlate with subsets of morphological features from the corresponding sample image. We apply our approach, ImageCCA, to three data sets, two from TCGA and one from GTEx v6, and we find three types of biological associations. In TCGA, we find gene sets associated with the structure of the extracellular matrix and cell wall infrastructure, implicating uncharacterized genes in extracellular processes. Across studies, we find sets of genes associated with specific cell types, including muscle tis- sue and neuronal cells, and with cell type proportions in heterogeneous tissues. In the GTEx v6 data, we find image features that capture population variation in thyroid and in colon tissues associated with genetic variants, suggesting that genetic variation regulates population variation in tissue morphological traits. The software is publicly available at: https://github.com/daniel-munro/imageCCA.

Somatic mutations are early drivers of tumorigenesis and tumor progression. However, the mutations typically occur at variable positions across different individuals, resulting in the data being too sparse to test meaningful associations between variants and phenotypes. To overcome this challenge, we devised a novel approach called Gene-to-Protein-to-Disease (GPD) which accumulates variants into new sequence units as the degree of genetic assault on structural or functional units of each protein. The variant frequencies in the sequence units were highly reproducible between two large cancer cohorts. Survival analysis identified 247 sequence units in which somatic mutations had deleterious effects on overall survival, including consensus driver mutations obtained from multiple calling algorithms. By contrast, around 75% of the survival predictive units had been undetected by conventional gene-level analysis. We demonstrate the ability of these signatures to separate patient groups according to overall survival, therefore providing novel prognostic tools for various cancers. GPD also identified sequence units with somatic mutations whose impact on survival was modified by the occupancy of germline variants in the surrounding regions. The findings indicate that a patient’s genetic predisposition interacts with the effect of somatic mutations on survival outcome in some cancers.